[發明專利]一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法

有效

• 申請號: 201811562124.3
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109402244B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 張明;趙秀玲;左二偉;陸陽清;魏巍
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/6879
• 分類號: C12Q1/6879;C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 蘇雪雪

1.一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法，其特征在于，所述方法為：構建Y染色體含熒光報道基因的雄性哺乳動物模型；雄性哺乳動物與雌性哺乳動物進行交配后，通過觀察熒光基因在胚胎中的表達鑒定動物胚胎性別為雄性或雌性；

所述雄性哺乳動物模型的構建方法為：在Y染色體兩相鄰的基因間選擇打靶區，并確定打靶序列，根據打靶序列構建含熒光報道基因的donor載體；然后在sgRNA和Cas9 mRNA的共同作用下，Y染色體基因組被剪切，然后通過DNA存在修復模板的情況下通過同源重組進行修復的功能，將熒光報道基因定點插入Y染色體中；

所述打靶區位于Ddx3y基因和Uty基因之間；

所述打靶序列為5’-AGACTAGAGAGGCTCAATTCTGG-3’；

所述含熒光報道基因的donor載體的序列為SEQ ID NO:2;

所述sgRNA的體外轉錄模板擴增方式為：以質粒px330為模板，合成引物序列，在引物序列上添加T7啟動子序列通過PCR擴增雙鏈DNA，為體外轉錄sgRNA提供模板，所述引物序列的上游引物序列為：sgRNA-IVT-F：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACTAGAGAGGCTCAATTCGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’；

下游引物序列為：sgRNA-IVT-R：5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’；

所述Cas9 mRNA的體外轉錄模板擴增方式為：以質粒px260為模板，合成引物序列，在引物序列上添加T7啟動子序列通過PCR擴增雙鏈DNA，為體外轉錄Cas9提供模板，所述引物序列的上游引物序列為：

CAS9 IVT F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTCAGGTTGGACCGGTG-3’；

下游引物序列為：CAS9 IVT R：5’-GACGTCAGCGTTCGAATTGC-3’。

2.根據權利要求1所述的一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法，其特征在于，所述PCR反應體系為：

補水至總體積50μL。

3.根據權利要求1所述的一種哺乳動物胚胎性別鑒定方法，其特征在于，所述哺乳動物為小鼠。