[發明專利]狂犬病毒熒光PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201811560784.8
• 申請日: 2018-12-20
• 公開（公告）號: CN109439803A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 湖北金雀醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發明涉及一種采用熒光PCR技術特異性檢測樣品中狂犬病毒核酸存在的試劑盒。利用本發明的試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在狂犬病毒核酸，該試劑盒能夠靈敏地檢測并鑒別樣品中存在的狂犬病毒，其檢測下限為10拷貝每反應體系，在疾病監測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。

技術領域

本發明涉及一種采用熒光PCR技術特異性檢測樣品中狂犬病毒核酸存在的試劑盒，屬于狂犬病毒的體外診斷領域。

背景技術

狂犬病毒（Rabies Virus）屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬。外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內含有單鏈RNA。是引起狂犬病的病原體。狂犬病毒具有兩種主要抗原：一種是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能與乙酰膽堿受體結合使病毒具有神經毒性，并使體內產生中和抗體及血凝抑制抗體，中和抗體具有保護作用；另一種為內層的核蛋白抗原，可使體內產生補體結合抗體和沉淀素，無保護作用。

狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的傳染病。多數動物實驗證明，在潛伏期和發病期間并不出現病毒血癥，狂犬病的發病過程可分為3個階段：局部組織內繁殖期、侵入中樞神經期、向各器官擴散期。 狂犬病毒進入人體，沿周圍傳入神經而到達中樞神經系統，因此頭、頸部、上肢等處咬傷和創口面積大而深者發病機會多。狂犬病毒主要存在于患病動物的延腦、大腦皮層、小腦和脊髓中。唾液腺和唾液中也常含有大量病毒，人被患狂犬病的動物咬傷、抓傷或經粘膜感染均可引起狂犬病，在特定條件下也可以通過呼吸道氣溶膠傳染。潛伏期長短不一，多數在3個月以內，國內報告平均66.9天。4~10%病人的潛伏期超過半年，1%超過1年，文獻中最長的一例為6年。狂犬病一旦發病，死亡率幾乎是100%。

在實驗室檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現出要替代以病毒培養和血清學檢測為主的傳統檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測的特異性和敏感性的基礎。

本發明針對狂犬病毒特異的靶序列設計引物和Taqman探針，利用real-time RT-PCR的方法，用來鑒別檢測樣品中狂犬病毒核酸，可以快速獲得特異性檢測結果。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是快速準確地檢測樣品中是否存在狂犬病毒，提供一種特異性檢測狂犬病毒的熒光PCR試劑盒。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：

一種特異性檢測樣品中狂犬病毒的試劑盒，組分包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有相關的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有逆轉錄酶和熱啟動Taq酶，陰性質控品為無RNase和DNase水，陽性質控品為含有狂犬病毒檢測靶序列的RNA。

PCR反應液中用于核酸擴增的引物為P1和P2，P1和P2為針對狂犬病毒基因組群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物；PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針為Probe1，Probe1為針對狂犬病毒基因組群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針，其中熒光報告基團X1為FAM，熒光淬滅基團Y1為Eclipse（見表1）。

表1 檢測狂犬病毒的引物和探針序列

本發明的另一個目的是提供本熒光PCR檢測試劑盒在檢測狂犬病毒的應用方法，包括：

試劑盒選用的PCR反應體系為20 μl，包括2×PCR緩沖液10 μl、10mmol/L dNTP 1.0 μl、25μmol/L引物各0.5 μl、10μmol/L 探針0.2 μl、逆轉錄酶和熱啟動Taq酶混合液0.8 μl、樣品RNA 2 μl，加滅菌水至終體系20 μl。