[發(fā)明專利]一種植物樣品中內(nèi)源性磷酸糖類化合物的前處理方法及定量檢測方法

有效

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• 申請日: 2018-12-19
• 公開（公告）號: CN109358134B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 馮鈺锜;羅曉彤;蔡保東
• 申請（專利權）人: 武漢綠劍可瑞信科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 張秋燕

本發(fā)明公開了一種植物樣品中包括內(nèi)源性海藻糖?6?磷酸在內(nèi)的多種磷酸糖類化合物的分析方法。該方法先以溶劑提取內(nèi)源性磷酸糖，之后用反相SPE小柱吸附并除去提取液中的疏水性雜質(zhì)，再利用衍生化試劑中的重氮基團與磷酸糖類化合物共有的磷酸基團發(fā)生衍生化反應，結(jié)合液相色譜?質(zhì)譜，實現(xiàn)了植物樣品中內(nèi)源性磷酸糖同分異構體的分離檢測。該方法簡單、準確、高通量，既能實現(xiàn)磷酸糖同分異構體在親水色譜柱上的基線分離，又能保證較高的檢測靈敏度，最終可實現(xiàn)在微量植物組織樣品中內(nèi)源性磷酸糖的分離檢測。

技術領域

本發(fā)明涉及一種植物樣品中內(nèi)源性磷酸糖類化合物的前處理及定量分析方法，屬于分析化學領域。

背景技術

磷酸糖類化合物是植物中重要的信號分子，并在許多生理過程包括種子發(fā)育，幼年-成年轉(zhuǎn)變階段，花卉過渡期，芽分支，衰老期和胚胎成熟期中發(fā)揮重要作用。然而，磷酸糖類化合物在植物體內(nèi)的作用機理還不得而知。因此，建立準確、高靈敏的分析方法是探索磷酸糖類化合物在植物中作用的關鍵。

迄今為止，人們開發(fā)了許多分析方法用于磷酸糖類化合物在植物中的分析檢測。在這些方法中，LC-MS的方法因其高靈敏度和高選擇性已成為磷酸糖類化合物分析方法的主流，然而仍存在問題：

一是，磷酸糖類化合物有較強的親水性，很難在傳統(tǒng)反相色譜柱上保留，并且磷酸糖類化合物同分異構體之間的色譜分離也成為了一大難題。基于此，人們引入了高效強陽離子交換色譜來分離磷酸糖類化合物，這使得這類化合物在色譜柱上的保留有了較大的改善。然而，在強陽離子交換色譜的色譜流動相中往往加入了高濃度的鹽，這在一定程度上降低了質(zhì)譜的檢測靈敏度，也會在一定程度上對質(zhì)譜儀造成損傷。親水作用色譜可以很好的解決這個問題，磷酸糖類化合物在親水柱上有較強保留，同時親水柱所使用的流動相也可以與質(zhì)譜完美匹配，但使用親水柱分離磷酸糖的同分異構體時，仍存在無法基線分離的問題，這會影響定量的準確性。

二是，由于T6P的離子化效率不佳，在CID上的碎裂行為不佳，導致其在MS上的信號響應差，且復雜植物基質(zhì)會給后續(xù)的檢測帶來干擾，導致靈敏度低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術存在的不足而提供一種植物樣品中內(nèi)源性磷酸糖類化合物的樣品前處理及定量分析方法，實現(xiàn)了磷酸糖同分異構體之間的基線分離，極大程度提高了分析物的檢測靈敏度。

本發(fā)明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為：

一種植物樣品中內(nèi)源性磷酸糖類化合物的前處理方法，主要包括以下步驟：

1)在植物樣品中定量加入磷酸糖的同位素內(nèi)標，然后以溶劑提取，得到植物樣品提取溶液；

2)將步驟1)所得植物樣品提取溶液用氮氣吹干，之后用硼酸緩沖溶液復溶，所得復溶溶液緩緩通過SPE小柱并收集流出液；

3)向步驟2)所收集的流出液中加入重氮衍生化試劑，之后經(jīng)振蕩、離心后，得到上清液，即完成植物樣品中內(nèi)源性磷酸糖類化合物的前處理，該上清液(無需吹干復溶)直接用于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，實現(xiàn)對植物樣品中的內(nèi)源性磷酸糖類化合物的定量檢測。

按上述方案，所述重氮化衍生化試劑包括骨架、增敏基團、重氮基團三部分，重氮衍生化試劑的重氮基團與磷酸糖分析物的磷酸基團發(fā)生反應。該重氮衍生化試劑的結(jié)構通式如式1所示，其中A為喹啉甲基或苯甲基等，當A為喹啉甲基時，B即為氫原子；當A為苯甲基時，B可為氨基，伯胺或仲胺基團等。

N₂＝A-B 式1

按上述方案，所述SPE小柱由50-200mg含有疏水功能基團的硅膠顆粒填充而成。其中，所述的疏水功能基團主要指C18或C8基團等。