[發明專利]一種植物樣品中內源性磷酸糖類化合物的前處理方法及定量檢測方法

有效

• 申請號: 201811559072.4
• 申請日: 2018-12-19
• 公開（公告）號: CN109358134B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 馮鈺锜;羅曉彤;蔡保東
• 申請（專利權）人: 武漢綠劍可瑞信科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 張秋燕

1.一種植物樣品中內源性磷酸糖類化合物的前處理方法，其特征在于主要包括以下步驟：

1)在植物樣品中定量加入磷酸糖的同位素內標，然后以溶劑提取，得到植物樣品提取溶液；

2)將步驟1)所得植物樣品提取溶液用氮氣吹干，之后用硼酸緩沖溶液復溶，所得復溶溶液通過反相SPE小柱并收集流出液；

3)向步驟2)所收集的流出液中加入重氮衍生化試劑進行化學衍生，實現對磷酸糖化合物的衍生標記，之后經振蕩、離心后，得到上清液，即完成對植物樣品中內源性磷酸糖類化合物的前處理，所述上清液直接用于高效液相色譜-串聯質譜進行分析檢測。

2.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征在于所述重氮衍生化試劑的結構通式如式1所示，

N₂＝A-B 式1

其中A為喹啉甲基或苯甲基，當A為喹啉甲基時，B即為氫原子；當A為苯甲基時，B可為氨基或伯胺基團。

3.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征在于步驟1)中溶劑提取步驟分為兩步，先以脂溶性溶劑溶解植物樣品中的脂溶性雜質，隨后加入水提取磷酸糖類化合物。

4.根據權利要求3所述的前處理方法，其特征在于所述脂溶性溶劑的為選自三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、乙醚、正己烷、乙酸乙酯中一種或幾種與乙腈的混合溶液，其中乙腈占脂溶性溶劑的體積比的范圍為50％-70％。

5.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征在于步驟1)中所得樣品提取溶液體積與步驟2)中反相SPE小柱填料的質量比值在(2-20)μL：1mg之間。

6.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征在于步驟2)中，硼酸緩沖溶液中硼酸鹽濃度為40-100mM，pH范圍為5.5-7.0。

7.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征在于步驟3)中，重氮衍生化試劑溶解于二甲亞砜中形成重氮衍生化試劑溶液，濃度范圍在0.014-0.1mM之間。

8.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征在于步驟2)中所收集得通過反相SPE小柱的流出液與步驟3)中加入重氮衍生化試劑的溶液的體積比在2：3至3：2之間。

9.根據權利要求1所述的前處理方法，其特征在于步驟3)中進行化學衍生時，反應溫度為4-25℃之間，pH在5.5-7之間，反應時間在30-180min之間。

10.一種植物樣品中內源性磷酸糖的定量分析檢測方法，其特征在于將權利要求1所述前處理方法所得上清液通過分析儀器采集響應信號或者數據，進而采用穩定同位素內標結合標準曲線定量法測定植物樣品中內源性磷酸糖的含量；其中，分析儀器采用液相色譜-質譜儀聯用，色譜柱采用親水色譜柱。