[發明專利]一種質粒以及噬菌體輔助的連續定向進化系統和定向進化方法

有效

• 申請號: 201811557458.1
• 申請日: 2018-12-19
• 公開（公告）號: CN109943581B
• 公開（公告）日: 2023-02-10
• 發明（設計）人: 劉陳立;李小明;崔金明
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 吳乃壯

本發明涉及膜蛋白定向進化領域，特別涉及一種質粒以及噬菌體輔助的連續定向進化系統和定向進化方法。一種質粒，包括AP1質粒和AP2質粒中的一種或兩種；AP1質粒攜帶gIII基因，并且該質粒的啟動子與核糖體結合位點之間設置有功能蛋白識別位點；AP2質粒攜帶功能蛋白基因。本發明設計新的輔助質粒AP1和AP2，將目標蛋白對胞內外底物分子的轉運活性與AP1上的gIII表達偶聯，通過這種間接的方式將SP的繁殖能力與目標蛋白的活性偶聯，達到連續定向進化目的蛋白的效果。

技術領域

本發明涉及膜蛋白定向進化領域，具體而言，涉及一種質粒以及噬菌體輔助的連續定向進化系統和定向進化方法。

背景技術

在基因組中，大約有30％的基因產物是膜蛋白，這個比例顯示膜蛋白在生物體中的重要性。膜蛋白主要包括信號受體、轉運蛋白、離子通道蛋白及一些酶類，對細胞代謝、生理平衡、胞內調節至關重要。在藥物研發設計過程中，很多膜蛋白是藥物設計的靶點，然而膜蛋白結構及生化信息的匱乏制約了藥物設計的發展，因為膜蛋白的不穩定性及不溶性導致科研人員很難獲得高純度的膜蛋白進行其三維結構的解析及研究。針對膜蛋白的這些特性，定向進化或許可作為強有力的工具幫助科研人員理解膜蛋白結構及其生物功能的關系。

傳統的誘變及基因重組的方式進化膜蛋白耗時耗力，需要建突變庫，反復篩選進行(Journal of Theoretical Biology,2000,205(3):483-503)。當前較新穎的脂質體展示等方式操作復雜，還需引入昂貴的體外翻譯系統，成本較高(Biophysics,2015,11:67-72)。

哈佛大學David R Liu團隊發明了一種噬菌體輔助持續進化系統(PACE)。該系統主要包含三個部分，第一部分將需要進化的基因置于噬菌體M13基因組上并替換原有的gIII基因，形成SP，SP缺少gIII無法侵染宿主并產生子代噬菌體；第二部分將SP侵染及產生子代噬菌體所需的gIII基因置于額外的質粒上進行表達，形成輔助質粒AP，gIII的表達受SP上的目的基因活性的調控，即將SP在細胞內的繁殖能力與目的基因的生物活性偶聯在一起；第三部分是誘變質粒MP，利用阿拉伯糖誘導物誘導MP上的基因DNAQ926、dam和seqA表達，使DNA復制過程中錯誤堿基不能修復，突變率提高幾百倍。當帶有目的基因的SP侵染宿主后，SP在宿主胞內進行遺傳物質的復制，在MP的幫助下，會產生SP的各種突變體。若SP上的目的基因獲得正向突變，則AP質粒上的gIII蛋白表達，能夠包裝出具有侵染性的子代SP噬菌體并分泌到胞外，進入下一輪的侵染、突變、子代循環；若SP上的目的基因不突變或者負面突變，則AP質粒上的gIII蛋白不表達，產生的子代不分泌到胞外或者數量較少；進化池是以一定流速持續被稀釋，正面突變的SP可以持續產生子代并保留在池中，負面突變的SP會不斷被流出池中并消失。David R Liu團隊用PACE系統成功進化了T7RNA聚合酶(NATURE.2011April；472:498–505)、蛋白酶(Nature Communications,2014,5:5352.)、DNA結合蛋白(Nature Methods,2015,12(10):939.)等并賦予這些蛋白新的特性，但并未涉及膜蛋白領域，現存的PACE系統并不適合對膜蛋白進行定向進化。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明設計新的輔助質粒AP1和AP2，AP2上的功能基因表達的蛋白抑制AP1上gIII蛋白的表達，轉運蛋白將底物轉運進胞內，底物分子可以解除功能蛋白的抑制效果，即將轉運蛋白對胞外底物分子的轉運活性與AP1上的gIII表達偶聯，通過這種間接的方式將噬菌體的繁殖能力與轉運蛋白的轉運活性偶聯，達到連續定向進化目的蛋白的效果。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種質粒，包括AP1質粒和AP2質粒中的一種或兩種；

AP1質粒攜帶gIII基因，并且該質粒啟動子與核糖體結合位點之間設置有功能蛋白識別位點；