[發明專利]一種在宮頸癌檢測中應用的試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201811555722.8
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109554473A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 李旭輝;張雷;郭書娟
• 申請（專利權）人: 敬善生物科技江蘇有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 北京漢鼎理利專利代理事務所(特殊普通合伙) 11618
• 代理人: 潘滿根

本發明涉及一種在宮頸癌檢測中應用的試劑盒及其應用，所述試劑盒包括檢測MSF1基因甲基化的試劑，所述檢測MSF1基因甲基化的試劑是檢測MSF1基因第2種轉錄本NM_001113493.1的第一個外顯子上游225～305bp處的CpG島區段甲基化的試劑。本發明所檢測的MSF1基因的CpG區域在和MSF1基因的其他區域比較起來，宮頸癌中的陽性率最高；通過鎖核酸修飾的PCR擴增引物能提高引物的Tm值從而高靈敏檢出MSF1的甲基化DNA片段。

技術領域

本發明涉及分子診斷領域，特別涉及一種在宮頸癌檢測中應用的試劑盒 及其應用。

背景技術

已有研究表明人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發生的高危因素。通 過觀察細胞形態的宮頸液基薄層細胞檢測(TCT)聯合HPV檢測是目前臨 床用于篩查宮頸癌的主要方法。TCT受人為干擾因素大，從取樣-涂片-觀察 -判讀都受人為因素的影響；而HPV感染多提示短暫性感染，對預測宮頸癌 的發生價值相對較低。目前從腫瘤發生的分子機制入手來尋找腫瘤早診的分 子標志物已經成為一種趨勢。基因啟動子區域CpG島甲基化能使基因表達沉默，從而引起一系列細胞的分子水平事件。目前國際已經公認基因甲基化 是腫瘤發生進展過程中的早期事件。因此通過檢測基因的甲基化對于預測細 胞的癌變已經開始應用在不同的腫瘤早期診斷上，例如通過外周血中游離 DNA的基因甲基化早診大腸癌；通過分析肺泡灌洗液細胞中基因甲基化早 診肺癌，等等。

發明內容

本發明提供一種在宮頸癌檢測中應用的試劑盒，所述試劑盒包括檢測 MSF1基因甲基化的試劑，所述檢測MSF1基因甲基化的試劑是檢測MSF1基 因第2種轉錄本NM_001113493.1的第一個外顯子(位于1～363bp)的 225～305bp之間的CpG島區段甲基化的試劑。MSF1基因第2種轉錄本 NM_001113493.1參見文獻Theo deVos,Reimo Tetzner,FabianModel,et al., Circulating Methylated SEPT9DNA in Plasma Is a Biomarker forColorectal Cancer.Clinical Chemistry,2009,55(7):1337-46；第一個外顯子(位于1～363bp) 的225～305bp之間序列為SEQ ID NO:1：

CCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGC CGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCC。

在一種實施方式中，所述試劑盒包括樣品DNA提取試劑、DNA甲基化修 飾轉化試劑以及基于熒光定量PCR方法檢測MSF1基因甲基化的試劑，所述 基于熒光定量PCR方法檢測MSF1基因甲基化的試劑是檢測MSF1基因第2種 轉錄本NM_001113493.1的第一個外顯子上游225～305bp處的CpG島區段甲基 化的試劑。

在一種實施方式中，所述試劑盒還包括用PCR方法檢測內對照參考基因 的試劑，所述內對照參考基因優選為ACTB基因；檢測所述內參基因的試劑 包括一對非甲基化位點擴增引物、一條檢測非甲基化位點探針。

在一種實施方式中，檢測所述ACTB基因的試劑包括擴增ACTB基因引 物和探針：上游引物序列SEQ ID NO:2：ATAATAAAAAGGAGGTTGGAT； 下游引物序列SEQ ID NO:3：CTCCCRCAAAACAACCAC；和檢測探針序列 SEQ ID NO:4：CCACCTTACCCTAAACACTACAAC。

在一種實施方式中，所述檢測MSF1基因甲基化的試劑包括擴增MSF1基 因的一對在5’端鎖核酸修飾的引物和一條檢測甲基化位點的探針：上游引 物序列SEQ ID NO:5：+TT+T+AGTTAGCGCGTAGGGTTC；下游引物序列 SEQ ID NO:6：+AA+C+TAATAAACAACGAATCGCG；和檢測探針序列SEQ ID NO:7：ACGCCCCCGACGAAACC。