[發明專利]一種基于RPA檢測番茄褪綠病毒的方法

在審

• 申請號: 201811552637.6
• 申請日: 2018-12-19
• 公開（公告）號: CN109371173A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 宋建;金鳳媚;薛俊
• 申請（專利權）人: 天津市農業生物技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明公開了一種基于RPA檢測番茄褪綠病毒的方法，主要包括：總RNA提取及cDNA的合成；設計檢測番茄褪綠病毒的RPA檢測引物；然后進行檢測。實驗結果顯示：本發明的方法能有效快速、準確地檢測出感染番茄褪綠病毒的植株。該方法對于病害的防治至關重要。

技術領域

本發明提供一種快速、簡捷的番茄褪綠病毒的檢測方法，屬植物保護領域。

背景技術

番茄褪綠病毒病（Tomato Chlorosis Virus，ToCV）是一種由煙粉虱傳播的新的病毒病，暴發后在我國迅速蔓延，并逐年加重。番茄褪綠病毒病屬于長線形病毒科（Closteroviridae）、毛線病毒屬（Crinivirus）。侵染寄主植株后表現為下部葉片葉脈間慢慢褪綠或黃化，隨后逐漸向上部葉片蔓延，葉脈逐漸變成深綠色，染病葉片變得厚而脆，植株長勢也變弱，其病癥與生理性缺素癥或營養元素缺乏相似。目前，番茄褪綠病毒病已成為我國番茄生產中一種毀滅性的新病害，嚴重威脅著我國番茄產業未來的健康發展。

目前，檢測番茄褪綠病毒病國際上主要采用RT-PCR技術，而血清學檢測方法應用得較少。分子生物學檢測主要是通過病毒的核酸來檢測病毒，它比血清學方法的靈敏度要高，能檢測到更高數量級的病毒，特異性強、操作簡便、可用于大量樣品檢測。自PCR技術發明以來，已經成為病毒檢測一種普遍采用的方法。但由于PCR技術對儀器的依賴度高，需要精密的溫度循環儀器才能完成擴增過程。加之成本高、耗時長，這些局限性使其應用大多限制于條件完善的實驗室內，難以廣泛應用于現場檢測。

近年來，恒溫核酸擴增技術的出現恰可解決技術的局限，它對儀器的要求大為簡化，反應時間明顯縮短，因而日益受到關注。重組酶聚合酶擴增技術（RPA），即是恒溫核酸擴增技術的一種，可在常溫下進行反應，且反應快速、靈敏度高、特異性強、操作簡便。目前RPA技術在醫學病原物的快速診斷中得到了一些應用，農業領域中主要用于轉基因作物的檢測。用于植物病毒檢測的報道較少，番茄褪綠病毒病是近幾年番茄上最嚴重的病害之一，快速、準確地檢測該病原對于病害防治至關重要。

發明內容

為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容：

一種用于檢測番茄褪綠病毒的特異性引物，其特征在于所述的引物序列為

F4: 5’-GATTTGATAAATGAGGTTAGACCCAAAATG-3’，SEQ ID NO:1

R5:5’-CGTTTCTTTTCATAAGTAGGTTCGAGATAA-3’；SEQ ID NO:2。

本發明進一步公開了采用上述的特異性引物進行番茄褪綠病毒的檢測方法，其特征在于按如下的步驟進行：

（1）總RNA 提取及cDNA 的合成：將提取的RNA制備成cDNA，-20℃保存備用；

（2）引物設計：設計檢測番茄褪綠病毒的RPA檢測引物；

（3）檢測：以制備的cDNA為模板，利用設計的引物進行RPA擴增，同時設置陰性對照，RPA擴增體系的配制方法如下: 向含有凍干酶粉的0.2 mL TwistAmp反應管中加入再水化緩沖液29.5μL，去離子水10μL，上、下游引物各2.5μL，終濃度為0.4μmol/L)，模板cDNA3μL，最后再加入醋酸鎂溶液2.5μL，280 mmol /L；將RPA擴增體系充分混勻，置于39℃的金屬浴上反應40 min，RPA反應結束后，利用純化試劑盒對RPA擴增產物進行回收純化，取產物5μL于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上觀察結果。

本發明更進一步公開了上述方法在用于快速有效的鑒定出感染番茄褪綠病毒的植株方面的應用。實驗結果顯示：基于RPA檢測番茄褪綠病毒的新方法更簡便快捷、靈敏度更高，在實際生產和科研中能夠有效節約人力和物力。