[發明專利]一種488nm激發的免洗SNAP-tag探針及其制備方法

有效

• 申請號: 201811550856.0
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111333618B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 徐兆超;喬慶龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D401/14
• 分類號: C07D401/14;C07D401/06;C07D473/18;C07D519/00;C09K11/06;G01N21/64;A61K49/00
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明提供了一種488nm激發的免洗SNAP?tag探針及其制備方法，該免洗SNAP?tag探針是在4,5?位雙取代的萘酰亞胺染料中引入螺環剛性結構并設計合成的一系列可用于488nm激發的免洗SNAP?tag探針，其結構式如(1)所示。剛性結構的引入不僅限制了分子內扭轉，提高了熒光分子的穩定性及亮度，還增加了探針分子的平面性。這導致SNAP?tag探針分子在水中形成強烈π?π作用，導致熒光的淬滅。而與SNAP?tag結合后，探針分子熒光得到釋放，最高可增強28倍。該系列探針能夠實現活細胞內對SNAP?tag的特異性標記，達到免洗熒光成像。此外，由于穩定性及亮度的提升，該系列探針還可用于SIM(結構光照明顯微鏡)，STED(受激輻射損耗)等超分辨熒光成像領域。

技術領域

本發明屬于蛋白標記領域，具體涉及一種488nm激發的免洗SNAP-tag探針及其制備方法。

背景技術

熒光成像技術已經逐漸成為在細胞層次到個體水平研究蛋白質功能的強有力工具。由于具有尺寸小、熒光發射光譜寬泛、可選擇熒光顏色多樣等優點，有機小分子熒光染料在蛋白標記領域逐漸成為熒光蛋白的替代者。但是有機小分子染料是外源物種，存在的問題是不能夠像熒光蛋白一樣由細胞源生，所以無法控制在細胞中的數量以及細胞中的位置。為了解決這個問題，化學家發展了多種生物正交的方法將小分子染料共價連接到目標蛋白上，從而可以進一步跟蹤研究目標蛋白的位置和功能。其中，目前應用最廣泛的是蛋白標簽技術，該技術通過遺傳編碼的方法首先將標簽蛋白融合到目標蛋白上，然后這種蛋白標簽與熒光底物發生專一的酶促共價連接反應，從而實現將小分子熒光染料特異性連接到目標蛋白的目的。

利用蛋白標簽技術實現活細胞蛋白成像時，熒光底物需要滿足多種性能要求，至少包括熒光底物具有良好的細胞透膜性、與蛋白標簽之外的生物大分子無結合，與蛋白標簽反應快、蛋白標記前后熒光有明顯變化以提高信噪比等。其中，自由的熒光染料無熒光或很弱，與蛋白標簽標記后熒光顯著增強，這樣的熒光信號能夠有效避開背景熒光以及沒有反應的熒光底物的干擾。這一性能使染料在進行活細胞成像時可以省掉多次洗細胞這樣的有損細胞的操作。

SNAP-tag標簽法已經成為目前應用最為廣泛的蛋白質標記技術，通過其與目標蛋白的融合可以對目標蛋白進行示蹤、功能的監測等。目前，已有多種商業的SNAP-tag熒光染料被開發出來，其主要是基于環境不敏感的羅丹明與花菁染料。這類染料能夠與SNAP-tag能夠達到很高的反應速率，但是反應前后熒光變化較小(通常增加1-2倍)。因此，在對細胞著色后需要多次洗滌才能達到比較好的染色效果。而對于環境敏感型染料，由SNAP-tag結合前水環境到結合后的疏水的蛋白表面會使其熒光增強倍數增加，有可能會達到免洗的效果；此外 SNAP-tag探針還可以基于聚集誘導淬滅、PET等機制實現熒光背底的減弱。由此可見，對于SNAP-tag探針的設計有多種方式可以遵循，如何通過合適的方式達到最佳識別效果一直是科研工作者研究的重要方向。尤其在單個蛋白功能研究的今天，單分子和超分辨成像等技術對熒光染料穩定性和亮度提出高要求的同時，對熒光信號真實性也提出了更高的需求，而背景增高會造成錯誤信號的增加，無法得到可信的成像結果。因此，設計出光穩定更好、反應速率更高的免洗SNAP-tag熒光探針顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種488nm激發的免洗SNAP-tag探針，該系列探針與SNAP-tag蛋白結合后熒光增強倍數可達28倍，可實現活細胞內的免洗熒光成像。

本發明的另一目的是提供一種488nm激發的免洗SNAP-tag探針的制備方法，該方法具有通用性，相比于目前嘌呤引入方法擁有步驟簡單、易于提純等優點。

本發明提供一種488nm激發的免洗SNAP-tag探針，以萘酰亞胺為熒光團，通過4,5-位剛性結構的調節使萘酰亞胺的熒光穩定性、亮度得到大幅度提升，實現了SNAP-tag蛋白的免洗超分辨熒光成像。此外，萘酰亞胺由環境敏感型染料蛻變為環境不敏感型熒光染料，在與SNAP-tag結合前后熒光峰型及波長不隨極性變化而發生變化，保持了熒光信號的準確性。