[發明專利]一種免洗標記特定蛋白質的熒光探針及其合成方法和應用

在審

• 申請號: 201811550855.6
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111333652A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 徐兆超;苗露;喬慶龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D487/04
• 分類號: C07D487/04;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明提供一種免洗標記特定蛋白質的熒光探針及其合成方法和應用。該熒光探針化學結構特征如下：熒光團母體是萘酰亞胺類染料，萘酰亞胺發色團母體連接取代基R，具體結構如式(1)所示。該小分子熒光探針在嘌呤基團的淬滅作用下熒光微弱，其能夠專一性的識別SNAP標簽蛋白并與其共價結合，結合后因嘌呤基團離去而熒光恢復。通過基因工程方法將SNAP標簽蛋白與目標蛋白融合表達，利用該小分子熒光探針與SNAP標簽蛋白的專一識別進而標記目標蛋白。由于標記前后熒光強度顯著增強，標記后不需要清洗的步驟即可以直接應用，該探針可以在體外免洗標記，也可以免洗標記活細胞內的任一蛋白質，在生物及醫學領域有極其重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物分析檢測領域，具體涉及一種免洗標記特定蛋白質的熒光探針及其合成方法和應用。

背景技術

蛋白質的定點標記對于活細胞內蛋白質的定位與追蹤具有重要的意義。通過小分子熒光探針標記蛋白來研究活細胞中蛋白質的位置、功能、以及蛋白-蛋白間通訊。目前常用的蛋白標及技術包括熒光蛋白融合法，單位點非天然氨基酸法，以及蛋白標簽方法。熒光蛋白標記法存在蛋白尺寸較大、熒光相對穩定性差、且缺少近紅外波段等缺點。非天然氨基酸的篩選過程復雜，耗時長，而且需要tRNA合成酶與改造的目標蛋白共表達，繁瑣的改造與表達過程限制了非天然氨基酸技術的應用。相比之下，蛋白標簽技術首先將標簽蛋白與目標蛋白的融合表達，隨后帶有底物基團的熒光小分子通過與標簽蛋白的專一性作用實現標記，該方法操作簡單，可以選擇任一熒光團作為母體，不但顯示出熒光探針優越的光物理特性，而且對標記的位置與時間精準控制，被廣泛的應用于目標蛋白的標記。目前常用的蛋白標簽包括Halo，PYP，SNAP，BL等，其中SNAP標簽是較常用的一個蛋白標簽，他通過與O⁶-烷基鳥嘌呤衍生物的專一、共價連接而實現標記。各式的熒光小分子被設計出來用于快速、不可逆的蛋白標記，并且應用于藥物監控、蛋白-蛋白相互作用、超分辨顯微成像等。

盡管如此，目前大多數用于SNAP標簽蛋白的小分子探針在標記過程中需要清洗掉未反應的小分子后再成像觀察。這一清洗過程時間冗長，不利于目標蛋白的實時觀察與追蹤，通常情況下，多數非特異性結合的小分子清洗不徹底導致信噪比高，影響觀測。因此，與SNAP蛋白反應前后有熒光變化的小分子探針的設計就顯得尤為重要。目前已經有一些免洗的SNAP熒光探針被設計出來，包括DRBG-488，CBG-549-QSY7等，但其結構復雜，合成過程繁瑣。最近報道的BGSBD探針盡管結構簡單，但是該熒光團的熒光性能較差，應用受限。

發明內容

本發明的目的是提供一種免洗標記特定蛋白質的熒光探針及其合成方法和應用該免洗標記特定蛋白質的熒光探針能夠快速、專一、免洗的標記目標蛋白的小分子熒光探針，該探針可應用于體外檢測或者活細胞內目標蛋白的生物成像。

本發明所述的一種免洗標記特定蛋白質的熒光探針，該探針分子結構式如下：

其中：R為：(CH₂)_nCH₃,(n＝0-4),芐基、吡啶亞甲基等。

一種免洗標記特定蛋白質的熒光探針的合成方法，合成路線如下：

具體合成步驟如下：

(1)中間體N-(4-羥甲基)芐基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亞胺的合成

將N-(4-羥甲基)芐基-4-溴-1,8-萘酰亞胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪伯胺。將反應液緩慢升溫至100-140℃，并在氮氣保護下反應10-24h。減壓除去溶劑，硅膠柱分離，以體積比為200:1-30:1的二氯甲烷和甲醇為洗脫劑，除去溶劑，得棕黃色固體N-(4-羥甲基)芐基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亞胺。

(2)SNAP蛋白的熒光探針的合成