[發(fā)明專利]一種免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針及其合成方法和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811550855.6
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111333652A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐兆超;苗露;喬慶龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C07D487/04
• 分類號: C07D487/04;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 張晨

1.一種免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針，其特征在于該探針分子結(jié)構(gòu)式如下：

其中R為：(CH₂)_nCH₃,(n＝0-4),芐基或吡啶亞甲基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針的合成方法，其特征在于具體步驟如下：

(1)中間體N-(4-羥甲基)芐基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亞胺的合成

將N-(4-羥甲基)芐基-4-溴-1,8-萘酰亞胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪伯胺，將反應(yīng)液緩慢升溫至100-140℃，并在氮氣保護下反應(yīng)10-24h。減壓除去溶劑，硅膠柱分離，以體積比為30～200:1的二氯甲烷和甲醇為洗脫劑，除去溶劑，得棕黃色固體N-(4-羥甲基)芐基-4-脂肪胺基-1,8-萘酰亞胺；

(2)SNAP蛋白的熒光探針的合成

將N-(4-羥甲基)芐基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亞胺，叔丁醇鉀，2-氨基-6-(N-甲基)四氫吡咯基鳥嘌呤、叔丁醇鉀置于史萊克瓶中，氮氣置換2-5次后加入2-10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室溫反應(yīng)2-10h后，加壓出去溶劑，硅膠柱分離，以體積比為10～100:1的二氯甲烷和甲醇為洗脫劑，除去溶劑得靶向SNAP蛋白的熒光探針。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針的合成方法，其特征在于步驟(1)中，N-(4-羥甲基)芐基-4-溴-1,8-萘酰亞胺與脂肪伯胺的質(zhì)量比為1:0.5-2；N-(4-羥甲基)芐基-4-溴-1,8-萘酰亞胺的質(zhì)量與乙二醇甲醚的體積比為50-100:1mg/mL；

所述脂肪伯胺包括N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺、N,N-二丙基乙二胺、N,N-二丁基乙二胺、N,N-二芐基乙二胺或N,N-二吡啶亞甲基乙二胺。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針的合成方法，其特征在于步驟(2)中，N-(4-羥甲基)芐基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亞胺、2-氨基-6-(N-甲基)四氫吡咯基鳥嘌呤、叔丁醇鉀質(zhì)量比為1:1-3:0.5-2；N-(4-羥甲基)芐基-4-脂肪氨基-1,8-萘酰亞胺的質(zhì)量與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為20-60:1mg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于，該免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針用于體外目標蛋白的免洗標記，或者細胞內(nèi)特定蛋白的免洗標記。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：所述的免洗標記過程如下：(1)通過基因工程方法將SNAP標簽蛋白與目標蛋白融合表達；(2)該熒光探針通過與SNAP標簽蛋白專一性共價連接實現(xiàn)對目標蛋白的標記。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針的應(yīng)用，其特征在于：免洗標記特定蛋白質(zhì)的熒光探針的的標記過程中，熒光探針標記目標蛋白后不需要清洗，直接進行光譜檢測或者熒光成像。