[發明專利]一種高亮度、高穩定性的細胞膜碳酸酐酶Ⅸ熒光探針

有效

• 申請號: 201811550668.8
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111333605B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 徐兆超;周偉;喬慶龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D311/82
• 分類號: C07D311/82;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明提供了一種高亮度、高穩定性的細胞膜碳酸酐酶Ⅸ熒光探針，該探針基于羅丹明6G熒光母體、連接苯磺胺靶向基團，其結構式如(1)所示，該熒光探針有著高度的細胞膜非滲透性，同時利用苯磺胺與人碳酸酐酶Ⅸ中的鋅原子快速配位結合，實現了細胞膜碳酸酐酶Ⅸ的免洗成像。其結構簡單、原料廉價易得、合成便捷，在細胞膜碳酸酐酶Ⅸ領域的研究中有著廣闊前景。

技術領域

本發明屬于熒光探針領域，具體涉及一種高亮度、高穩定性的細胞膜碳酸酐酶Ⅸ熒光探針。

背景技術

碳酸酐酶是一含鋅金屬酶，通過催化CO₂水化反應及某些脂、醛類水化反應，參與多種離子交換，維持機體內環境穩態，在人體生命活動過程中起著關鍵性作用。而碳酸酐酶Ⅸ是其家族中一種重要的亞型，在直接由于缺氧導致的腫瘤中過量表達，與腫瘤細胞增殖、細胞黏附、腫瘤進展相關，已被眾多科研工作者證實可以作為乏氧腫瘤的標志物。目前關于碳酸酐酶的檢測，主要通過免疫印跡法與質譜法，二者均需要進行細胞的裂解，不適合活體細胞的實時監測。

熒光成像技術作為新興的分析技術，具有高靈敏度和高選擇性的優異特點，且可進行實時觀察、對生物影響較小，在生物學、醫學和環境科學等領域已得到廣泛應用。應用熒光成像技術對碳酸酐酶Ⅸ的可視化檢測，可以準確、方便、及時地提供人體乏氧腫瘤的診斷信息，為腫瘤治療帶來巨大便利。然而，目前商業化的碳酸酐酶Ⅸ的熒光探針匱乏，不能為乏氧腫瘤的診斷提供有力工具。因此，開發設計可實時監測細胞膜表面碳酸酐酶Ⅸ的熒光探針具有重要意義。

發明內容

本發明提供一種高亮度、高穩定性的細胞膜碳酸酐酶Ⅸ熒光探針，該探針擁有光穩定性高、亮度高等優勢。

本發明提供一種高亮度、高穩定性的細胞膜碳酸酐酶Ⅸ熒光探針，該探針以羅丹明6G為熒光母體，苯磺胺為識別基團，具體的化學結構如下：

其中：n＝0,1,2或3。

該熒光探針具有高度的非滲透性，難以進入細胞，同時通過苯磺胺基團非特異性與人碳酸酐酶Ⅸ中的鋅原子配位結合，從而在細胞膜上聚集，實現快速、清晰的細胞膜碳酸酐酶Ⅸ的成像的目的。

一種高亮度、高穩定性的細胞膜碳酸酐酶Ⅸ熒光探針的合成方法，其合成路線如下：

具體合成步驟如下：

(1)中間體羅丹明6G-羧酸的合成

羅丹明6G溶于乙醇中，加入強堿試劑的水溶液，回流反應5-10h后，減壓除去有機溶劑，硅膠柱分離，洗脫劑為體積比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，減壓除去溶劑后得到中間體；

其中，羅丹明6G與強堿的質量比為1:0.2-0.4，水與乙醇的體積比為1:5-8，羅丹明6G與乙醇的質量與體積比為1:20-40g/mL；

(2)中間體羅丹明6G-琥珀酰亞胺羧酸酯的合成

將羅丹明6G-羧酸，N-羥基琥珀酰亞胺，縮合試劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽依次加入到二氯甲烷中，室溫攪拌10-16h；減壓除去溶劑得粗產品；

其中，羅丹明6G-羧酸與N-羥基琥珀酰亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的質量比為1:0.2-0.4:0.6-0.8，羅丹明6G-羧酸與二氯甲烷的質量與體積比為1:40-60g/mL；

(3)中間體羅丹明6G-甲胺烷基酸得合成

將羅丹明6G-琥珀酰亞胺羧酸酯粗產品、甲胺烷基酸鹽酸鹽、碳酸鉀依次加入到乙腈中，室溫攪拌過夜；減壓除去溶劑，硅膠柱分離，洗脫劑為體積比50-10:1的二氯甲烷和甲醇，減壓除去溶劑后得紫色固體；