[發明專利]一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針及其合成

有效

• 申請號: 201811549890.6
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111333641B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 徐兆超;喬慶龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D471/06
• 分類號: C07D471/06;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明提供了一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針及其合成，該探針以4,5?雙取代萘酰亞胺為母體，4?甲基?2,3,5,6?氮雜苯為響應基團，其結構式如(1)所示，4,5?位的環己二胺有效抑制了分子內扭轉，使探針穩定性、亮度得到極大提升。此外，熒光母體的熒光半峰寬小，對溫度、極性等均不敏感，在不同微環境下能夠保持熒光信號的穩定性。本探針能夠與親二烯體系發生高速的生物正交反應，在與環辛烯結合后熒光增強約9倍，能夠用于活細胞內的免洗熒光標記。

技術領域

本發明屬于熒光探針領域，涉及一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針及其合成。

背景技術

生物正交反應是一類在生理條件下能夠特異性與目標分子發生的高速、高效的化學反應，被廣泛應用于生物分子的定點標記。隨著研究中對時間分辨率的更高要求，基于狄爾斯-桑爾德反應(Diels-Alder)機制的四嗪與親二烯的生物正交反應憑借突出的反應速率、正交性、生物相容性，逐漸取代了金屬催化的正交反應。因此，借助這類生物正交反應與有機小分子熒光染料，可以實現實時對活細胞內生物大分子的精準標記、成像等。

然而，針對四嗪類生物正交反應的熒光探針仍然匱乏，并且此類探針面臨雙重的問題。首先，熒光染料的穩定性限制了探針在超分辨領域及單分子檢測技術中的應用：目前多數探針以Bodipy與熒光素類染料為熒光團，兩類染料雖然熒光量子效率高但是在高強度激光下分子很容易被氧化而發生淬滅。其次，反應后能夠實現高熒光增強倍數的探針較少：目前，為了達到活細胞內高的信噪比，洗去未反應的探針是必不可少的步驟，隨之而帶來時間分辨率的下降、細胞損傷等問題。因此，用于四嗪類生物正交反應的高穩定性免洗熒光探針存在很大需求，從而達到更高空間及時間分辨率下對生物分子的監測。

發明內容

本發明提供一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針，該類染料穩定性高，與親二烯反應后熒光恢復達到高的熒光增強倍數(9倍)。

本發明提供一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針的合成方法，該方法步驟簡單、易于提純等優點。

本發明一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針，通過萘酰亞胺4,5-位環己二胺的引入達到了熒光穩定性、亮度得到大幅度提升。與Bodipy、熒光素相比穩定性更高，同時保持了亮度高、半峰寬窄等優勢。

一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針，該系列熒光探針具有如下結構：

一種用于四嗪類生物正交標記的增強型熒光探針的合成方法，此系列熒光探針合成路線，如下：

具體合成步驟如下：

(1)中間體BCOEt-NBr的合成：

將4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，4-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽溶于無水乙醇中。將反應液加熱至40-90℃，攪拌1-24h。將反應液泠卻至室溫后，減壓除去溶劑后，硅膠柱分離，以體積比1:6-4的二氯甲烷和石油醚為洗脫劑，減壓除去溶劑得米白色固體BCOEt-NBr。

(2)中間體BCOEt-DAC的合成：

將BCOEt-NBr，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入環己二胺。將反應液緩慢升溫至50-140℃，并在氮氣保護下反應10-24h。減壓除去溶劑，硅膠柱分離，以體積比400-50:1的二氯甲烷和甲醇為洗脫劑，除去溶劑，得棕黃色固體BCOEt-DAC。

(3)中間體BCOOH-DAC的合成

取BCOEt-DAC溶于甲醇中，并向反應液中滴加2M氫氧化鈉溶液。室溫下反應1-3h后，減壓蒸餾除去甲醇，過濾并用水洗滌濾餅干燥后得BCOOH-DAC。

(4)中間體NHSB-DAC的合成