[發明專利]豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法及用途

有效

• 申請號: 201811548566.2
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109628404B
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 單體中;劉嘉琪;有文靜;徐子葉;農秋雲;汪以真
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/54;C12N15/85;C12Q1/6851
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法，包括以下步驟：獲得原代豬皮下脂肪細胞；培養細胞，待細胞生長至密度為60％～70％時，轉染pBABE?puro?hTERT質粒；轉染48±2h后用含4μg/mL嘌呤霉素的30％血清的DMEM培養基篩選；篩選48±2h后換液為DMEM培養基進行培養；待細胞形成細胞克隆時，將所得的細胞克隆消化下進行培養，直至鑒定獲得永生化豬皮下脂肪前體細胞模型。豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的用途是：用于脂肪前體細胞增殖，或者分化聚酯機制、調控機理的研究。

技術領域

本發明通過轉染端粒酶質粒的方法來構建過表達端粒酶逆轉錄基因的豬皮下脂肪前體細胞，獲得永生化細胞系，屬于生物和現代農業技術領域的應用技術。

背景技術

脂肪組織在動物機體的能量代謝中扮演著重要的作用，是重要的儲存和能量供應場所。脂肪組織作為內分泌器官分泌的脂聯素、瘦素等一些脂肪因子，對肥胖、糖尿病等代謝疾病起著重要的作用。其中，脂肪沉積則主要決定于脂肪前體細胞的增殖、分化和聚酯成熟，直接影響到糖脂代謝和人類的健康。另一方面，從畜牧生產的角度出發，皮下脂肪沉積直接影響著豬肉的品質和飼料的利用效率，降低了經濟效益。因此，研究脂肪沉積顯得尤為迫切。而通過建立豬皮下脂肪前體細胞體外培養模型，探索豬前脂肪細胞分化、增殖、聚酯的機理及調控機制，對深入了解脂肪組織的形成和脂質代謝過程，進而為脂肪沉積和肉品質形成調控提供理論依據。因此，建立前體細胞體外培養模型進而探究脂肪細胞分化聚酯在醫學、生命科學、畜牧學等領域都具有重要的科學意義。

目前生命科學研究常涉及兩類細胞，一種為原代細胞，另一種為永生化細胞或細胞系。目前，豬原代脂肪前體細胞培養不利于傳代，而且，每次分離原代脂肪細胞都需要屠宰3-7日齡仔豬，極大提高了實驗成本和實驗的成功率。但目前未見豬脂肪細胞的細胞系或永生化細胞。端粒酶逆轉錄酶(TERT)能延長端粒(縮短的端粒其細胞復制能力受限)，從而增強體外細胞的增殖能力，它可以被用來構建永生化細胞系。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法，以及該細胞系的用途。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種穩定轉染hTERT構建永生化豬皮下脂肪前體細胞的方法(豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法)，包括以下步驟：

1)、獲得原代豬皮下脂肪細胞(接種豬皮下脂肪前體細胞)；

2)、培養細胞，待細胞生長至密度為60％～70％時，轉染pBABE-puro-hTERT質粒；

3)、轉染48±2h后用含4μg/mL嘌呤霉素的30％血清的DMEM培養基篩選；

4)、篩選48±2h后換液為DMEM培養基(即，普通完全培養基)進行培養；

5)、待細胞形成細胞克隆時，將所得的細胞克隆消化下來進行培養(傳代到新的12孔板中培養)，直至鑒定獲得永生化豬皮下脂肪前體細胞模型(豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系)。

該步驟5)中，經過多次傳代、鑒定等，從而得到永生化豬皮下脂肪前體細胞模型。

作為本發明的豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法的改進，所述步驟5)采用hTERT基因表達的半定量檢測：

hTERT的特異性引物為：

hTERT-F GACCTCCATCAGAGCCAGTC

hTERT-R GTTCTTGGCTTTCAGGATGG；

選用有hTERT基因表達的細胞系。

作為本發明的豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法的改進，用熒光定量PCR檢測增殖標志基因DHFR和KI67的表達情況；熒光定量PCR引物分別為：