[發明專利]豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法及用途

有效

• 申請號: 201811548566.2
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109628404B
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 單體中;劉嘉琪;有文靜;徐子葉;農秋雲;汪以真
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/54;C12N15/85;C12Q1/6851
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法，屬于穩定轉染hTERT構建永生化豬皮下脂肪前體細胞的方法，其特征是包括以下步驟：

1）、用0.15%的Ⅰ型膠原酶消化獲得原代豬皮下脂肪細胞，接種豬皮下脂肪前體細胞；

2）、培養細胞，待細胞生長至密度為60％~70％時，轉染pBABE-puro-hTERT質粒；

3）、篩選方法及周期：轉染48±2h后用含4μg/mL嘌呤霉素的30%血清的DMEM培養基篩選；

4）、篩選48±2h后換液為DMEM培養基進行培養；篩選培養4-6天后，出現豬皮下脂肪前體細胞的單克隆細胞簇；

5）、將篩選所得的單克隆細胞簇通過胰酶消化分離，分別進行擴大培養和hTERT基因表達檢測、增殖及分化功能鑒定，最終獲得豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系。

2.根據權利要求1所述的豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法，其特征是：

所述hTERT基因表達檢測為半定量檢測，包括設計特異性hTERT基因的半定量PCR引物，PCR產物長度為262 bp，并采用半定量PCR檢測不同代次豬脂肪前體細胞永生化細胞中hTERT基因表達情況：

hTERT的特異性半定量PCR引物為：

hTERT-F： GACCTCCATCAGAGCCAGTC

hTERT-R：GTTCTTGGCTTTCAGGATGG。

3.根據權利要求1所述的豬皮下脂肪前體細胞永生化細胞系的構建方法，其特征是：設計豬增殖標志基因DHFR和KI67的特異性熒光定量PCR引物，并采用熒光定量PCR檢測豬DHFR和KI67的表達情況；特異性擴增豬DHFR和KI67的熒光定量PCR引物分別為：

DHRF-F: GGTGATTATGGGTAGGAAGACCT

DHRF-R: ATTCTGGCTGCTCAGTAAGTTTT

Ki67-F: GCACCAGGCTTTACGGAAG

Ki67-R: ATTTTAGCCACTTCTGACTTTCG。