[發明專利]乳酸菌抗菌肽及高效表達及抗菌抗癌活性的應用

有效

• 申請號: 201811548163.8
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN110105433B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 羅學剛;賀軍芳;金杜欣;俞曉亭;張同存
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12N15/31;C12N15/70;A61K38/10;A61P35/00
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發明涉及一種乳酸菌抗菌肽及高效表達及抗菌抗癌活性的應用，通過分析干酪乳桿菌(L.casei HZ1)的基因圖譜，得到抗菌肽LHH1的基因序列，如序列1所示，模擬其二級結構，確定該肽的主要理化性質。依照乳酸菌密碼子偏愛性優化并全合成LHH1基因，將該基因片段克隆到乳酸菌表達載體pE?SUMO中，構建得到pE?SUMO?EA?LHH1重組質粒。將重組質粒轉化到大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS中，對其進行誘導表達并分離純化。本方法所獲得的抗菌肽LHH1熱穩定性強，有良好的抗菌、抗癌效果，可作為優良的防腐添加劑及發酵劑用于食品、藥品、飼料等行業中。

技術領域

本發明涉及基因工程和生物技術領域，尤其是涉及一種新型乳酸菌抗菌肽 LHH1的高效表達及抗菌抗癌活性的應用。

背景技術

自上世紀90年代以來，對抗菌肽等新型抗菌物質的研究日益增加，其中防御素、富組蛋白(Histatin)等抗菌活性肽家族是人體免疫系統的天然成分，具有抗菌活性強、毒副作用小，耐藥菌株少等優點，備受關注。抗菌肽在機體受到病毒、細菌等攻擊時會被誘導產生，是動、植物和人類先天性免疫機制的組成部分，具有廣譜抗菌作用，尤其對一些產生抗生素耐藥性的病原菌，故而在農業、醫療、食品等多個領域應用潛力很大。

乳酸菌是一類以糖為原料產生乳酸的細菌，具有提高食品營養價值、改善食品風味、延長保存時間、對人畜安全無害，有保健功能的益生菌，因此被視為理想的蛋白多肽類物質的口服載體與表達載體。目前為止，已發現上千種天然抗菌肽，但其來源較復雜，安全指數待考究，因此，人們希望能從益生菌內探尋相關的抗菌肽，以保證其使用的安全性。

人們為了得到抗菌肽主要采用了三種方法：1.直接從生物體中提取天然肽； 2.化學方法合成；3.采用基因工程的方法。前兩種由于成本過高，不適用于大規模生產，基因工程表達的方法越來越被大家所認可。先構建高效表達的發酵菌株，并建立其純化和發酵的條件和方法，以便抗菌肽的生產推廣和其在多方面的應用。

發明內容

本發明通過基因工程技術表達了一種來自干酪乳桿菌的新型抗菌肽LHH1，得到其高效表達的發酵菌株，并證實了LHH1的抗菌抗癌活性，以及在不同溫度下LHH1的穩定性。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種新型乳酸菌抗菌肽，核苷酸序列見SEQ ID NO.1所示。

而且，所述抗菌肽的氨基酸序列、分子量、電荷數、等電點、疏水性分別為：AFALIAGALYRIFHRR，1875.25，+3，11.71，0.98。

一種新型乳酸菌抗菌肽的表達方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1.合成權利要求1所述的氨基酸序列，該序列為新型乳酸菌抗菌肽基因；

S2.構建含抗菌肽重組大腸桿菌基因工程菌；

S3.抗菌肽融合蛋白的誘導表達；

S4.抗菌肽的純化。

而且，所述S1過程包括：根據干酪乳桿菌基因GenBank：(MOAG00000000.1) 并應用生物信息學工具計算各組合的一級特征參數、預測二級和抗菌活性，設計出具有醫療潛力的抗菌肽LHH1；根據大腸桿菌對密碼子的偏愛性將抗菌肽的基因序列翻譯成核酸序列，在其兩端加上Bsa I和HindIII限制性內切酶位點和保護性堿基，合成引物F1、R1應用，所述引物的核苷酸序列如下SEQ ID NO.2 和SEQ ID NO.3。

而且，所述S2過程包括：構建抗菌肽表達質粒pE-SUMO-LHH1并測序鑒定，構建基因工程菌株pE-SUMO-EA-LHH1/Rosetta(DE3)pLysS并測序鑒定，所述測序鑒定SEQ ID NO.4，測序結果使用NCBI Blast與所設計的基因進行對比，選取兩者結果一致的重組菌為測序結果正確的重組菌。