[發(fā)明專利]一種甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學(xué)檢測方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811547575.X
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109652590B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 錢雯;陸偉;馬萬;楊志萍;李曉慶;趙天浩;潘繼菊;范宏錦;陳敏;陸柯今
• 申請（專利權(quán)）人: 云南沃森生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 北京市盈科律師事務(wù)所 11344
• 代理人: 羅東

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學(xué)檢測方法及應(yīng)用，所述方法以HAV(?)RNA為模板，運用RT?PCR法進行(?)RNA的檢測。若檢測到(?)RNA，則說明有HAV在復(fù)制，即樣品中有活著的HAV，若檢測不到(?)RNA，則說明沒有HAV復(fù)制，即樣品中沒有活的HAV；同時，檢測到(?)RNA時，亦可依據(jù)(?)RNA的含量來推斷樣品中活的HAV的量，進而推算出樣品中的HAV滴度。RT?PCR的高靈敏度性使得可在較短的培養(yǎng)時間內(nèi)檢測出代表HAV復(fù)制的(?)RNA的存在與否及其相對含量，進而在更少的時間內(nèi)完成病毒滅活效果的驗證和病毒滴度的測定，加速甲肝疫苗的研發(fā)進度以及減少成品甲肝疫苗的庫存期。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學(xué)檢測方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

甲型肝炎，簡稱甲肝，是一種由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）引起的高發(fā)病率的病毒性傳染病，可導(dǎo)致暴發(fā)流行，是我國重要的衛(wèi)生問題，接種甲肝疫苗是預(yù)防甲肝流行的最佳途徑。

目前使用的甲肝疫苗包括甲肝減毒活疫苗和甲肝滅活疫苗兩大類。其中，甲肝減毒活疫苗使用弱毒株進行生產(chǎn)，但存在毒力返祖、對免疫缺陷者可能存在誘發(fā)嚴重疾病的安全隱患。甲肝滅活疫苗是病毒培養(yǎng)后經(jīng)滅活而制成的疫苗，在安全性、有效性及適用范圍等方面均優(yōu)于減毒活疫苗。

在毒種選育和病毒培養(yǎng)階段，HAV病毒滴度是一個關(guān)鍵指標(biāo)，病毒滅活是甲肝滅活疫苗安全性的關(guān)鍵指標(biāo)，而現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》（下簡稱《中國藥典》）中的關(guān)于HAV的病毒滴定和病毒滅活驗證等的方法存在耗時長久、不利于甲肝疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)的問題，因此開發(fā)一種快速的檢測方法至關(guān)重要。

HAV屬于小核糖核酸病毒科小核糖核酸病毒屬，是無包膜的ss(+)RNA病毒，在病毒復(fù)制過程中，基因組(+)RNA轉(zhuǎn)錄成為(-)RNA；以(-)RNA為模板復(fù)制出子代基因組(+)RNA，同時基因組(+)RNA作為mRNA指導(dǎo)相關(guān)病毒蛋白的合成，最終病毒蛋白和基因組(+)RNA組裝成為成熟HAV顆粒。從以上過程可見，(-)RNA僅存在于病毒的復(fù)制過程中。此前已有檢測HAV的RT-PCR法，但此類方法不能判定產(chǎn)物源自基因組(+)RNA還是(-)RNA，即不能判定病毒是否在進行復(fù)制、病毒是否依然存活。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明正是要解決上述技術(shù)問題，從而提出一種甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學(xué)檢測方法及應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供一種甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學(xué)檢測方法，其包括如下步驟：

S1、培養(yǎng)人二倍體細胞，并接種HAV，得到帶病毒細胞；

S2、從步驟S1得到的帶病毒細胞中提取總RNA；

S3、以所述總RNA作為模板，采用第一引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用核糖核酸酶處理逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，降解RNA；

S4、以步驟S3得到的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板，使用第二引物和第三引物進行第一次聚合酶鏈式反應(yīng)，得到第一次聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物；

S5、以步驟S4得到的產(chǎn)物為模板，使用第四引物和第五引物進行第二次聚合酶鏈式反應(yīng)，得到第二次聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物；

S6、將所述第一次聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物、第二次聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，判斷是否存在負鏈RNA。

作為優(yōu)選，所述第一引物的基因序列為TCCTACGTAATATCCGTGAT

GTTATCTAAGTA；所述第二引物的基因序列為TCCTACGTAATATCC；所述第三引物的基因序列為GTACCTATAATGCATCCTAATTTAGCAAAGCT