[發明專利]一種甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法及應用

有效

• 申請號: 201811547575.X
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109652590B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發明（設計）人: 錢雯;陸偉;馬萬;楊志萍;李曉慶;趙天浩;潘繼菊;范宏錦;陳敏;陸柯今
• 申請（專利權）人: 云南沃森生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 北京市盈科律師事務所 11344
• 代理人: 羅東

1.一種甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：S1、培養人二倍體細胞，并接種HAV，得到帶病毒細胞；S2、從步驟S1得到的帶病毒細胞中提取總RNA；S3、以所述總RNA作為模板，采用第一引物進行逆轉錄反應，用核糖核酸酶處理逆轉錄反應體系，降解RNA；S4、以步驟S3得到的逆轉錄反應產物為模板，使用第二引物和第三引物進行第一次聚合酶鏈式反應，得到第一次聚合酶鏈式反應產物；所述第一引物的基因序列為TCCTACGTAATATCCGTGATGTTATCTAAGTA，所述第二引物的基因序列為TCCTACGTAATATCC，所述第三引物的基因序列為GTACCTATAATGCATCCTAATTTAGCAAAGCTGTACAA，第四引物的基因序列為GCCGAATGTATTGGGGTCC，第五引物的基因序列為GTACCTATAATGCATCCT；S5、以步驟S4得到的產物為模板，使用第四引物和第五引物進行第二次聚合酶鏈式反應，得到第二次聚合酶鏈式反應產物；S6、將所述第一次聚合酶鏈式反應產物、第二次聚合酶鏈式反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，判斷是否存在負鏈RNA。

2.根據權利要求1所述的甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，所述步驟S1包括如下步驟：S11、將人二倍體細胞培養為單層細胞，并接種HAV，在36-38℃下吸附1-2h；S12、洗除未吸附病毒后加入維持液，在36-38℃下培養；S13、用細胞消化液收獲帶病毒細胞。

3.根據權利要求2所述的甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，所述步驟S3中所述的逆轉錄反應在逆轉錄反應體系中進行，所述逆轉錄反應體系包括：濃度為25mM的MgCl₂、10xRNA PCR緩沖液、RNase Free dH₂O、濃度為10mM的dNTP Mixture、逆轉錄抑制劑、AMV反轉錄酶、濃度為10μmol/L的第一引物、總RNA。

4.根據權利要求3所述的甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，所述逆轉錄反應包括在55℃下反應30min、在95℃下反應5min、在5℃下反應5min的步驟。

5.根據權利要求4所述的甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，所述步驟S4所述的第一次聚合酶鏈式反應在第一次聚合酶鏈式反應體系中進行，所述第一次聚合酶鏈式反應體系包括：濃度為25mM的MgCl₂、10×LA PCR緩沖液、濃度為10mM的dNTPMixture、TaKaRa LA Taq、第二引物、第三引物、逆轉錄反應產物和滅菌水。

6.根據權利要求5所述的甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，所述步驟S5所述的第二次聚合酶鏈式反應在第二次聚合酶鏈式反應體系中進行，所述第二次聚合酶鏈式反應體系包括：濃度為25mM的MgCl₂、10×LA PCR緩沖液、濃度為10mM的dNTPMixture、TaKaRa LA Taq、第四引物、第五引物、第一次聚合酶鏈式反應產物和滅菌水。

7.根據權利要求6所述的甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，所述第一次聚合酶鏈式反應、第二次聚合酶鏈式反應均包括：第一循環：在94℃下反應2min；第二循環：在94℃下反應30s、在55℃下反應30s、在72℃下反應1min；第三循環：在72℃下反應2min，其中第一循環的次數為1次，第二循環的次數為35次。

8.根據權利要求7所述的甲型肝炎病毒的負鏈RNA分子生物學檢測方法，其特征在于，所述步驟S6所述的電泳條件為電壓100V、反應時間15-30min。

9.一種如權利要求1-8任一項所述的方法在甲型肝炎病毒滴度滴定和滅活驗證中的應用。