[發明專利]非破壞性從單頭薊馬類昆蟲標本中高效提取DNA的方法

在審

• 申請號: 201811546925.0
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109371016A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 魯雯敏;王軍;席景會
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

非破壞性從單頭薊馬類昆蟲標本中高效提取DNA的方法屬生物技術領域，本發明包括：取樣：將單頭薊馬類昆蟲從酒精溶液中取出；扎孔：用00號昆蟲針對薊馬腹部刺穿；消化：將扎孔的標本放入裝有消化液離心管中，置金水浴上孵育；標本回收：孵育結束后，吸取保留的蟲體表皮至酒精溶液新的離心管中；DNA沉淀和吸附：在孵育好的消化液中加一定比例氯仿：異戊醇，吸取上清至新的無菌離心管中；漂洗：加入一定量的Buffer至過濾柱，室溫離心，丟棄濾液；吹干；洗脫DNA。本發明非破壞性從單頭薊馬類昆蟲標本中高效提取DNA，所回收的憑證標本完整且提取的DNA純度高，分類準確，能滿足種類鑒定的需要。

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體涉及一種非破壞性從單頭薊馬類昆蟲標本中高效提取DNA的方法。

背景技術

薊馬是纓翅目Thysanoptera昆蟲的通稱，是一個與人類關系密切的昆蟲類群，其種類繁多，數量豐富，分布廣泛。

薊馬個體較小，大部分種類體長0.5-5mm，薊馬種內還存在一定的形態變異，僅依靠傳統的分類方法對其外部特征進行種類鑒定,無法滿足實際工作的需要，而DNA提取技術是從核酸水平對薊馬類昆蟲進行物種鑒定和物種起源、遺傳及進化的探討，進而解釋物種多樣性、系統發育及進化規律的，因此獲取有效高質的DNA是進行昆蟲種類分子鑒定，分子水平進化和系統發育研究所必需的條件,但多頭提取昆蟲DNA會掩蓋個體的差異性,使得某些堿基突變無法識別,異種同型現象、近緣種的問題得不到有效解決；單頭提取濃度小、質量低、連續片段短,無法滿足高通量測序的要求；破壞性提取昆蟲DNA，需要充分研磨樣品,易造成人為污染,嚴重破壞樣品的組織形態及結構,使得極少數的珍貴標本無法保留，即不能將基因序列與標本一一對應起來,影響了昆蟲分類鑒定工作,尤其是一些害蟲分類鑒定工作,致使微小型昆蟲標本被錯誤鑒定分析屢見不鮮；傳統非破壞性提取昆蟲DNA,往往采用浸漬樣本，使用有毒或腐蝕性化學品，需要過夜孵育而耗費時間，需要整頭提取的蟲體,特別是捕食性昆蟲,要解剖捕食者以獲取不受污染的組織切片,使得主要形態特征受損,不能作為完整個體繼續保存,無法滿足昆蟲物種多樣性快速、準確鑒定需要。

發明內容

我們非破壞性從單頭薊馬類昆蟲標本中高效提取DNA的方法，標本無需研磨，只需在腹部扎孔的方式，經充分消化后，即可獲得高質量的DNA模板。不但解決了破壞性提取的缺點，傳統非破壞性提取的弊端，而且使得單頭提取濃度大,質量高,連續片段長,滿足了高通量測序的要求。

本發明的目的是提供一種非破壞性從單頭薊馬類昆蟲標本中高效提取DNA的方法，該方法能夠解決破壞性的提取薊馬DNA憑證標本無法保留和所獲得的DNA濃度小、質量低、結構片段短、純度不均一的問題，所提取的薊馬DNA濃度大、質量高、純度均一、結構片段完整，且憑證標本蟲體完整，主要特征清晰可辯，能夠達到形態分類學與分子系統學兩學科同步進行種類分子鑒定，發現新種、新記錄及隱存種，探求物種之間的系統發育及進化關系等。

1.一種非破壞性從單頭薊馬類昆蟲標本中高效提取DNA的方法包括下列步驟：

1.1取樣：將單頭薊馬類昆蟲從75％的酒精溶液中取出，在干凈濾紙上放置30s，用鑷子將標本轉移至載玻片上，再將載玻片放置在解剖鏡的視野中央；

1.2扎孔：將單頭薊馬類昆蟲的腹部朝上，用無菌的00號昆蟲針對薊馬的腹部刺穿4～6下，其中第I腹節除外；

1.3消化：將扎孔的單頭薊馬類昆蟲放入裝有250～350ul消化液和20～25ul蛋白酶K的1.5ml離心管，再將離心管放入金水浴上孵育3～4小時；

1.4標本回收：孵育結束后，吸取保留的蟲體表皮至50％～75％酒精溶液新的1.5ml離心管中，進行后續的玻片制作；