[發明專利]一種在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基的方法

有效

• 申請號: 201811546535.3
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN109503709B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發明（設計）人: 連惠勇
• 申請（專利權）人: 海南熱帶海洋學院
• 主分類號: C07K14/795
• 分類號: C07K14/795;C12N15/81
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

本發明提供一種在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基的方法，包括以下步驟：(1)將藻藍蛋白α亞基編碼基因與載體連接，得到重組質粒，所述重組質粒含有啟動子；(2)制備酵母感受態細胞，將重組質粒經電轉化法轉入酵母感受態細胞，培養得到酵母轉化子，篩選陽性酵母轉化子；(3)陽性酵母轉化子轉接入發酵培養基中培養。本發明成功實現在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基，發酵結束后，藻藍蛋白含量達到70.8～174.6mg/L，占總蛋白的43.5～66.8％。本發明方法不僅藻藍蛋白得率較高，操作簡單，原料易得，成本低，而且本發明在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基，為進一步研究藻藍蛋白的α亞基功能提供了大量的基礎材料。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基的方法。

背景技術

藻藍蛋白(Phycocyanin，簡稱PC，吸收光譜在610～640nm)是重要的捕光色素蛋白，不僅可以作為工業原料和食品添加劑。而且由于藻藍蛋白易于與生物素、抗體等蛋白質結合，因此藻藍蛋白作為熒光探針越來越受到重視。目前藻藍蛋白主要從螺旋藻中分離純化制得，但螺旋藻養殖困難，破壁困難，從螺旋藻中分離純化藻藍蛋白成本高、工藝復雜、得率低，而且原料浪費嚴重。酵母表達系統是迄今為止最為成功的高效表達系統，其細胞繁殖速度快，生長周期短，破壁容易，遺傳背景相對清楚，外源基因可穩定遺傳，表達產量高，成本低，特別適合用于蛋白表達。因此借助基因工程與發酵工程技術生產藻藍蛋白將成為本領域新趨勢。

此外，藻藍蛋白主要由α和β亞基組成，α和β亞基先通過二硫鍵形成(αβ)單體，再通過共價鍵形成(αβ)₃三聚體或(αβ)₆六聚體，至于組成PC的α和β亞基在行使生物學功能時，哪一個亞基更重要或是否需要特定的空間結構，國內外均未見報道。

發明內容

鑒以此，本發明的目的是提供一種在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基的方法，不僅解決現有技術中生產藻藍蛋白時成本高、得率低等問題，而且本發明在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基，為進一步研究藻藍蛋白的α亞基功能提供了大量的基礎材料。

本發明的技術方案是：

一種在酵母中表達生產藻藍蛋白α亞基的方法，包括以下步驟：

(1)將藻藍蛋白α亞基編碼基因與載體連接，得到重組質粒，所述重組質粒含有啟動子；

(2)制備酵母感受態細胞，將重組質粒經電轉化法轉入酵母感受態細胞，培養得到酵母轉化子，篩選陽性酵母轉化子；

(3)陽性酵母轉化子轉接入發酵培養基中培養。

優選的，所述藻藍蛋白源于極大螺旋藻。

優選的，所述酵母為釀酒酵母。

優選的，所述啟動子為GAL1或GAL10。

優選的，所述載體為pYES2。

優選的，步驟(2)中采用YNB培養基進行培養，所述YNB培養基包括以下成分：葡萄糖20～25g/L、硫酸銨0.5～0.7g/L、YNB 10～15g/L、亮氨酸20～30μg/L和組氨酸25～35μg/L，pH 5.0～5.5；培養的條件為：20～25℃、280～300r/min震蕩培養15～20h。

優選的，所述發酵培養基包括以下成分：酵母粉20～25g/L、胰蛋白胨10～15g/L、葡萄糖20～25g/L、半乳糖2～5g/L、甘油1～5g/L和亮氨酸5～20μg/L，pH5.5～6.0。

優選的，步驟(3)為：陽性酵母轉化子轉接入發酵培養基中，30～38℃、200～230r/min發酵培養36～48h，收集菌體，即得。

優選的，在發酵過程中，保持發酵罐中DO值始終維持25～30％。