[發(fā)明專利]一種采用離體葉片接種玉米灰斑病和發(fā)病的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811545301.7
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109439551A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝宗宜
• 申請（專利權(quán)）人: 靖西市秀美邊城農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京天奇智新知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 牙斐穎

本發(fā)明涉及一種植物灰斑病人工接種發(fā)病領(lǐng)域，特別涉及一種采用離體葉片接種玉米灰斑病和發(fā)病的方法，本申請的步驟如下:(1)培育感病玉米植株；(2)培養(yǎng)接種用病原菌；(3)選取離體葉片；(4)接種離體葉片；(5)保濕培養(yǎng)葉片。該方法操作簡單，在室內(nèi)就能完成，不受季節(jié)限制，占用場地少，效率高，重現(xiàn)性好，有效解決了灰斑病人工接種難成活、發(fā)病條件難把控、發(fā)病率不高的問題，有效的縮短了從接種到發(fā)病的時間，有助于灰斑病抗病性的快速鑒定，應(yīng)用價值大。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉植物病害人工接種發(fā)病領(lǐng)域，具體涉及本一種采用離體葉片接種玉米灰斑病和發(fā)病的方法。

【背景技術(shù)】

玉米灰斑病是玉米生產(chǎn)中的一種病害，它具有傳播快、難控制、嚴(yán)重導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收等特點，對玉米產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響。該病主要危害葉片，也侵染苞葉和葉鞘，嚴(yán)重時還可侵染莖稈。病斑由初感染的針尖狀褪綠的黃色小斑點，后期發(fā)展成長矩形與葉脈平行的灰褐色病斑，病斑在光下呈現(xiàn)透明狀，葉片兩面均可產(chǎn)生灰色霉層。病原菌在干燥條件下，能夠在地表的病殘體上安全越冬，成為來年的初感染源，而表土層下病殘體上的病原菌不能越冬存活，但有利于灰斑病的發(fā)生。降雨量多，空氣濕度高，氣候溫暖有利于灰斑病的發(fā)生和流行。

灰斑病的發(fā)生和流行對空氣濕度和溫度具有較高要求，針對接種發(fā)病方面的研究，自然接種和人工接種都存在不足之處。自然接種是將玉米植株種植于天然高發(fā)病害田塊自然環(huán)境下發(fā)病，研究依賴于自然條件下的溫度和濕度，因此具有不可控性，難以把握。一方面尋找多點適合發(fā)病的地塊，對試驗研究產(chǎn)生了限制，另一方面，植物生長的季節(jié)性造成了研究周期長。而工人接種雖能解縮短時間，無季節(jié)性限制，但由于灰斑病病菌對溫度和濕度要求較高，接種人員難以把控接種時間和方法，容易造成人工接種病菌難成活、接種發(fā)病率不高等問題。

目前，我國也有關(guān)于灰斑病病菌接種的技術(shù)，例如，中國專利：CN 105123175 B《一種玉米灰斑病的接種方法》，采用盆栽活體玉米植株作為接種材料，將病菌粗提取液接種到活體植株上，發(fā)病率雖高，但試驗仍然占用較大場地，耗費較多人力物力，而且，未經(jīng)純化的病菌容易摻雜其他病菌，影響灰斑病發(fā)病準(zhǔn)確性。而采用離體材料作為接種對象，以人工培養(yǎng)的菌株為致病菌，不僅操作簡單，占用場地少，花費少，效率高，而且用純化菌株做致病菌能大大提高病害發(fā)病準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

鑒于上述內(nèi)容，本發(fā)明提供一種采用離體葉片接種玉米灰斑病和發(fā)病的方法，以離體葉片為接種對象，以人工培養(yǎng)純化病菌作為致病菌，操作簡單、技術(shù)配套，有效解決人工接種病菌難成活和病害發(fā)病率不高的問題，為后續(xù)研究提供實際應(yīng)用價值。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案，包括以下步驟：

(1)培育感病玉米植株：選擇玉米灰斑病感病品種種植于花盆中，常規(guī)水肥管理，得到灰斑病易感植株；

(2)培養(yǎng)接種用病原菌：將從田間采集灰斑病感病葉片接種到含煙酰胺的玉米芯高粱粒粉培養(yǎng)基上，放置于溫度為25℃～28℃的人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d～7d。

(3)采集離體葉片：從步驟(1)盆栽的灰斑病易感植株中取新鮮干凈無病害葉片，裝于內(nèi)放有冰袋或干冰盒子中，4℃帶回室內(nèi)；

(4)接種離體葉片：離體葉片用剪刀剪成長約3cm，用小刀或鋼珠在葉片小塊上輕劃或輕輕摩擦制造微傷口，傷口以只損傷表皮為準(zhǔn)，挑取1cm長的正方形菌絲瓊脂塊，菌絲朝下緊貼放在離體葉片傷口；

(5)保濕培養(yǎng)葉片：每天用保濕液均勻噴灑步驟(4)接種的離體葉片，離體葉片放入培養(yǎng)基中，于人工氣候培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10d～15d。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)從田間采集灰斑病感病葉片進(jìn)行如下處理后再接種于玉米芯高粱粒粉培養(yǎng)基：將灰斑病感病葉片剪成一半有病斑一半健康無病斑長1cm的正方形小塊，2％次氯酸鈉消毒30s，用滅菌蒸餾水清洗3次，過濾紙吸干。