[發明專利]內胚層干細胞規模化制備功能性肝母細胞與肝實質細胞的方法及其應用

在審

• 申請號: 201811545297.4
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN111394297A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 程新;馮思思;吳佳穎;鄧小剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子細胞科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0735;C12N5/10;A61K35/407;A61P1/16
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;崔佳佳

本發明提供了內胚層干細胞規模化制備功能性肝母細胞與肝實質細胞的方法及其應用，具體地，本發明提供了一種誘導人類內胚層干細胞分化為肝母細胞和/或肝實質細胞的方法，包括步驟：在第一培養基、第二培養基、第三培養基的存在下，在培養體系中培養內胚層干細胞，從而獲得功能性的肝母細胞和/或肝實質細胞。本發明的功能性的肝母細胞和/或肝實質細胞具有非常高的分化率和純度，并且，本發明的肝實質細胞還具有有效的治療肝臟相關疾病的作用。

技術領域

本發明涉及生物技術和細胞治療領域。具體地，本發明涉及內胚層干細胞規模化制備功能性肝母細胞與肝實質細胞的方法及其應用。

背景技術

肝臟是人體內的最大分泌腺體，其同時具有內分泌和外分泌功能。內分泌功能主要為分泌多種激素如胰島素樣生長因子、血管緊張肽原、促血小板生成素。與之對應的外分泌功能則為膽汁的合成。肝實質細胞以膽固醇為原料，經多個步驟合成初級膽汁酸，其中關鍵酶為膽固醇7α-羥化酶。將膽固醇轉化為膽汁酸，這是肝臟清除膽固醇的主要方式。此外，肝臟在人體內的重要作用還表現在：(1)糖原儲存，肝臟將血液中多余的葡萄糖以肝糖原的形式儲存，為機體大量耗能之時提供能量；(2)藥物代謝及解毒功能，肝臟內藥物代謝及解毒酶類分為①藥物代謝一相酶，其主要家族為CYP450超家族，其參與外源及內源有機物質的氧化作用；②藥物代謝二相酶，其主要是以一相酶反應產物為底物進行結合反應的催化酶類；③藥物代謝三相酶，其主要作用為將肝臟細胞內代謝有毒物質轉出肝臟；(3)調節膽固醇的合成和轉運；(4)尿素代謝；(5)分泌血清蛋白，幼年肝臟分泌的主要血清蛋白為AFP，在成年肝臟中主要的血清蛋白為ALBUMIN,此外肝臟還分泌血清胰蛋白酶抑制劑AAT。

正因肝臟具有如此重要的生理功能，肝炎，肝硬化，急慢性肝衰竭等肝臟疾病致死率高居不下。中國為世界上人口最多的國家，也是乙型肝炎后肝硬化和原發性肝癌的高發國家，每年有50萬HBV肝炎新發病例，慢性乙型肝炎癥患者達1300萬，肝硬化發生率為30.2/10萬，重癥肝病的發生率在1％-3％之間，如果得不到有效救治，每年約有50多萬人死于上述疾病導致的終末期肝病，為家庭和社會帶來了嚴重的經濟負擔。

現階段對于重癥肝病患者最有效的治療方法為肝臟移植，然而，肝臟供體來源十分短缺，病人往往在肝源等待中喪失了生命。因此，找到新型的治療方法為亟需解決的問題。近來，肝實質細胞移植性治療為肝病患者帶來了希望，肝實質細胞移植是在體外將游離的、有生物學活性的肝實質細胞以一定的方式直接或間接移植到受體肝臟內，在受體內生長增殖并發揮正常肝實質細胞的作用，以修復受損肝臟或代替部分肝功能。但其仍然面對肝實質細胞資源短缺等嚴重問題。近年來，科學家們發現可在體外模擬肝臟發育的過程，將胚胎干細胞或是多能誘導干細胞直接分化形成具有肝臟功能的肝實質樣細胞，其能夠分泌血清白蛋白，以及具有部分CYP酶的解毒功能，但其分化存在以下幾點問題：1)安全性問題——任何殘留在分化體系中的未分化多能干細胞都有可能在體內形成腫瘤(畸胎瘤/Teratoma)；2)分化細胞的功能問題——由多能干細胞直接分化為功能性細胞十分困難，目前由多能干細胞直接分化的終末分化細胞和成體細胞相比，在功能上都有很大的差距；3)分化細胞的純度問題——多能干細胞的分化多能性決定了：誘導分化成的目標細胞中會參雜相當比例的同一和其他胚層的細胞類群，因而純化目標細胞十分困難，同時，也使有關胚層之間相互作用的研究難以進行。

近來，日本研究小組報道，將人類胚胎干細胞和臍靜脈內皮細胞以及間充質干細胞在體外共培養可誘導分化形成Liver Buds，所得Liver Buds在植入小鼠體內能夠形成小型的肝組織。但其所得肝實質細胞仍處于人類肝臟胚胎發育出生前階段，成熟肝臟相關功能較為缺失。因此，其仍不能滿足體外藥物篩選平臺，終末急性肝臟疾病治療等應用。隨后，Gordon Keller實驗室報道三維懸浮培養方法結合cAMP信號能夠促進由人類胚胎干細胞所得肝實質樣細胞的進一步成熟。但其分化過程涉及較多消化處理及細胞重聚等復雜過程，限制了功能性肝實質細胞的規模化制備。