[發明專利]一種基于酶聯免疫鑒別絲織品殘片的方法

有效

• 申請號: 201811541884.6
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109541218B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 陳茹茹;王秉;胡銘周;朱誠;胡智文
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/535;G01N33/543
• 代理公司: 浙江永航聯科專利代理有限公司 33304
• 代理人: 侯蘭玉

本發明涉及文物檢測技術領域，公開了一種基于酶聯免疫鑒別絲織品殘片的方法，本發明先制備了桑蠶絲絲素蛋白和柞蠶絲絲素蛋白的單克隆抗體，然后利用固定化木瓜蛋白酶對抗體進行處理，得到具有較高活性的Fab片段抗體，并將該片段和金納米粒子復合，得到具特異性的Fab?Au NP復合物。經酶聯免疫實驗表明，該復合物能高效性地鑒別出古代絲織品殘片的種類。本發明反應溫和、環保無害；在對古代絲織品進行檢測時，具有樣品用量少、直觀、快速和高靈敏性的特點。

技術領域

本發明涉及文物檢測技術領域，尤其涉及一種基于酶聯免疫鑒別絲織品殘片的方法。

背景技術

作為中華文明的重要象征和載體，絲綢承載著豐富的文化、技術和社會內涵，帶領古老的中國文明從絲綢之路走向世界，對促進世界人類文明的發展做出了不可磨滅的貢獻。

1958年，浙江錢山漾良渚文化遺址出土了一批絲線、絲帶和沒有炭化的絹片；20世紀80年代，在河南滎陽青臺村新石器時代遺址發現絲麻織物殘片。國內外很多學者對考古挖掘出土的絲綢殘留物進行分析，以期發現更早的絲綢。在古代絲綢的發掘中，由于氣候環境、時間、土壤和微生物等因素的影響，絲綢會呈現出不同的遺存形式：絲織品實物、灰化絲織品、礦化絲織品和泥化絲織品。對于保存形式比較完好的絲綢，通過傅里葉紅外光譜（FTIR）、拉曼光譜、X-射線衍射 (XRD) 和氨基酸分析 (AAA) 等傳統的方法即可鑒別。但隨著保存或者埋葬時間的延長，絲綢逐漸老化降解，為短鏈纖維或者肽段，甚至降解為氨基酸等小分子，它們的微痕跡遺存于土壤中。

古代絲織品殘片的織物含量相應減少，樣品雜質增多，干擾增大，若繼續沿用傳統的方法將很難對其做出準確的判斷，如何尋找一種更為科學的手段來鑒定古代絲織品一直是文物保護界的難題。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種基于酶聯免疫鑒別絲織品殘片的方法。利用本發明方法對古代絲織品殘片進行鑒別時，具有直觀、準確、高靈敏性的特點。

本發明的具體技術方案為：一種基于酶聯免疫鑒別絲織品殘片的方法，包括以下步驟：

1）蠶絲特異性抗體的制備：稱取桑蠶絲和柞蠶絲，經脫膠、溶解、透析、純化和冷凍干燥后，分別得到桑蠶絲絲素蛋白粉末和柞蠶絲絲素蛋白粉末；將兩種絲素蛋白粉末分別溶解在PBS中注射進SPF級Balb/C純種雌性小鼠體內，經多次脾臟免疫后，將脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經克隆、篩選、培養和純化后，分別得到桑蠶絲絲素蛋白單克隆抗體和柞蠶絲絲素蛋白單克隆抗體.

2）Fab片段抗體的制備：先在分離柱中對固定化木瓜蛋白酶進行活化，同時將步驟1）中所得兩種抗體分別在buffer交換柱中進行前處理，得到兩種抗體溶液；將兩種抗體溶液分別加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中，擰緊柱子蓋子，置于35-39℃恒溫震蕩孵化箱中酶解反應，采用親和層析法純化和凝膠過濾層析柱對酶解產物進行分離純化后，得到桑蠶絲絲素蛋白Fab片段抗體和柞蠶絲絲素蛋白Fab片段抗體。

在步驟2）中，本發明選用固定化木瓜蛋白酶制備Fab片段抗體。木瓜蛋白酶在催化過程中首先與底物快速結合，接著酶活性中心的巰基被底物的羰基酰化，形成酰化酶，最后是酰化酶的分解，生成產物，酶恢復到初始狀態。與游離酶切相比，固定化木瓜蛋白酶可更好地控制消化過程，酶解程度可通過控制時間來調節，可快速有效地將酶解產物和酶分開，無酶-抗體結合物的產生。同時，固定化的木瓜蛋白酶可以避免其在酸堿和有機介質中失活，熱穩定性提高，實現酶的反復利用，達到節約生產成本的目的。通過活化，可以提高酶活性，增加酶解速率。

3）Fab-Au NP復合物的制備：將步驟2）所得兩種Fab片段抗體進行硫醇化處理后，分別取50-80 μL加入到Au NP溶液中，于35-39℃恒溫震蕩孵化箱中反應40-50min，11000-14000rpm 離心10-20min后，重新分散在PBST中，得到Fab-BM-Au NP復合物和Fab-AP-Au NP復合物。