[發明專利]一種基于酶聯免疫鑒別絲織品殘片的方法

有效

• 申請號: 201811541884.6
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109541218B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 陳茹茹;王秉;胡銘周;朱誠;胡智文
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/535;G01N33/543
• 代理公司: 浙江永航聯科專利代理有限公司 33304
• 代理人: 侯蘭玉

1.一種基于酶聯免疫鑒別絲織品殘片的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）蠶絲特異性抗體的制備：稱取桑蠶絲和柞蠶絲，經脫膠、溶解、透析、純化和冷凍干燥后，分別得到桑蠶絲絲素蛋白粉末和柞蠶絲絲素蛋白粉末；將兩種絲素蛋白粉末分別溶解在PBS中注射進SPF級Balb/C純種雌性小鼠體內，經多次脾臟免疫后，將脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經克隆、篩選、培養和純化后，分別得到桑蠶絲絲素蛋白單克隆抗體和柞蠶絲絲素蛋白單克隆抗體；

2）Fab片段抗體的制備：先在分離柱中對固定化木瓜蛋白酶進行活化，同時將步驟1）中所得兩種抗體分別在buffer交換柱中進行前處理，得到兩種抗體溶液；將兩種抗體溶液分別加入到活化的固定化木瓜蛋白酶中，擰緊柱子蓋子，置于35-39℃恒溫震蕩孵化箱中酶解反應，采用親和層析法純化和凝膠過濾層析柱對酶解產物進行分離純化后，得到桑蠶絲絲素蛋白Fab片段抗體和柞蠶絲絲素蛋白Fab片段抗體；

兩種抗體的前處理的方法具體如下：將Buffer交換柱放入離心管內，2000-4000rpm 離心1-3 min，棄去離心出來的存儲液，加入 0.8-1.2mL 18-22 mM半胱氨酸消化液，2000-4000rpm離心1-3min，棄去離心出來的液體，重復離心2-4次；吸取 0.4-0.6m L抗體加入到柱子中，并將柱子放入新的離心管中，2000-4000rpm離心1-3min，收集離心出來含半胱氨酸的抗體溶液，待用；

3）Fab-Au NP復合物的制備：將步驟2）所得兩種Fab片段抗體進行硫醇化處理后，分別取50-80 μL加入到Au NP溶液中，于35-39℃恒溫震蕩孵化箱中反應40-50min，11000-14000rpm 離心10-20min后，重新分散在PBST中，得到Fab-BM-Au NP復合物和Fab-AP-Au NP復合物；

Fab片段抗體硫醇化的方法具體如下：按體積比1:8-12將10μM HS?(CH₂)₁₀?N-羥基琥珀酰亞胺基-11-巰基十一酸酯的四氫呋喃溶液與抗體 Fab片段溶液混合，在室溫下攪拌40-50min；

4）包被抗原的制備：按固液比0.8-1.2g/100mL將絲織品殘片溶于鈣醇溶液中，在96-100℃下加熱1.5-2 h，得到蠶絲蛋白溶液；取部分蠶絲蛋白溶液，加入Na₂CO₃/NaHCO₃緩沖液，并于6000-10000rpm離心5-15min，取上清液作為抗原包被液，抗原包被液濃度為1mg/mL；

5）抗原包被和封閉：將抗原包被液加入96孔板中，每組5個孔，每孔100 μL，加入兩組形成實驗組1、2，實驗組1后續加入Fab-BM-Au NP 復合物，實驗組2后續加入Fab-AP-Au NP復合物，并設立只加入Na₂CO₃/NaHCO₃緩沖液的陰性對照組、用BSA代替Fab-Au NP復合物的空白對照組和含有絲素蛋白溶液的陽性對照組，于1-5℃過夜包被，棄去包被液，洗滌；加入0.8-1.2wt% BSA，于35-39 ℃ 孵育1-3 h，封閉掉多余的結合位點后，棄去封閉液，洗滌；

6）免疫結合：將步驟3）中所得Fab-BM-Au NP復合物和Fab-AP-Au NP復合物稀釋為Fab-BM-Au NP復合物溶液和Fab-AP-Au NP復合物溶液，實驗組1每孔加入100 μL Fab-BM-Au NP復合物溶液，實驗組2每孔加入100 μL Fab-AP-Au NP復合物溶液，空白對照組加入等量PBST，于35-39℃孵育0.5-1.5 h，棄去后洗滌；每孔加入100 μL過氧化辣根酶標記的二抗，于35-39℃孵育0.5-1.5 h，棄去后洗滌；

7）TMB顯色：向孔板中分別加入50 μL A液和B液，置于黑暗環境下反應8-12 min，每孔加入100 μL 2mol/L H₂SO₄終止反應；

8）吸光度測量；將孔板置于酶標儀中，讀取450 nm處的吸光度數值，將孔板的陰性對照組OD均值加上 3×標準偏差作為實驗的cut-off值：

若實驗組1的OD均值陰性對照組的cut-off值，則絲織品殘片為桑蠶絲；若實驗組2的OD均值陰性對照組的cut-off值，則絲織品殘片為柞蠶絲。