[發明專利]基于反向擴增全長質粒和In-fusion連接的快速克隆方法

在審

• 申請號: 201811540662.2
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN111321160A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 金宗文;袁靜;羅擎穎;趙江林;衛小元;蘇少博;劉宇光
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63;C12N15/10
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 高星

1.一種快速克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：

設計用于擴增目的基因的第一引物對和用于擴增載體模板的第二引物對；其中，所述第一引物對包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物包括末端重疊序列A，第一下游引物包括末端重疊序列B；所述第二引物對包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物包括末端重疊序列B’，第一下游引物包括末端重疊序列A’，且所述末端重疊序列A與所述末端重疊序列A’反向互補，所述末端重疊序列B與所述末端重疊序列B’反向互補；

提供原始載體模板，采用PCR反向擴增技術擴增含有末端重疊序列A和末端重疊序列B的線性化載體，以及采用PCR反向擴增技術擴增含有末端重疊序列A’和末端重疊序列B’的目的基因；

采用連接酶將所述線性化載體的末端重疊序列A和所述目的基因的末端重疊序列A’連接，將所述線性化載體的末端重疊序列B和所述目的基因的末端重疊序列B’連接，得到環狀克隆載體；

將所述環狀克隆載體導入宿主細胞，進行表達。

2.如權利要求1所述的快速克隆方法，其特征在于，所述末端重疊序列A含有至少15bp；和/或

所述末端重疊序列B含有至少15bp。

3.如權利要求1所述的快速克隆方法，其特征在于，采用PCR反向擴增技術擴增含有末端重疊序列A和末端重疊序列B的線性化載體的步驟中，在PCR反向擴增結束后，采用DpnⅠ酶消化去除甲基化保護的原始載體模板。

4.如權利要求1所述的快速克隆方法，其特征在于，所述連接酶選自In-fusion酶。

5.如權利要求4所述的快速克隆方法，其特征在于，采用連接酶將所述線性化載體的末端重疊序列A和所述目的基因的末端重疊序列A’連接，將所述線性化載體的末端重疊序列B和所述目的基因的末端重疊序列B’連接，得到環狀克隆載體的步驟中，反應體系如下：

反應條件為：將所述反應體系混勻后，于45℃～55℃條件下孵育10～20min。

6.如權利要求1至5任一項所述的快速克隆方法，其特征在于，所述原始載體模板為空載體或重組質粒。

7.如權利要求1至5任一項所述的快速克隆方法，其特征在于，所述第一上游引物中，除所述末端重疊序列A外，還含有18bp～27bp。

8.如權利要求1至5任一項所述的快速克隆方法，其特征在于，所述第一下游引物中，除所述末端重疊序列B外，還含有18bp～27bp。

9.如權利要求1至5任一項所述的快速克隆方法，其特征在于，所述第二上游引物中，除所述末端重疊序列B’外，還含有18bp～27bp。

10.如權利要求1至5任一項所述的快速克隆方法，其特征在于，所述第二下游引物中，除所述末端重疊序列A’外，還含有18bp～27bp。