[發(fā)明專利]基于反向擴增全長質(zhì)粒和In-fusion連接的快速克隆方法

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• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN111321160A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金宗文;袁靜;羅擎穎;趙江林;衛(wèi)小元;蘇少博;劉宇光
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63;C12N15/10
• 代理公司: 深圳中一專利商標(biāo)事務(wù)所 44237
• 代理人: 高星

本發(fā)明提供了一種快速克隆方法，包括以下步驟：設(shè)計用于擴增目的基因的第一引物對和用于擴增載體模板的第二引物對；其中，所述第一引物對包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物包括末端重疊序列A，第一下游引物包括末端重疊序列B；所述第二引物對包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物包括末端重疊序列B’，第一下游引物包括末端重疊序列A’，且所述末端重疊序列A與所述末端重疊序列A’反向互補，所述末端重疊序列B與所述末端重疊序列B’反向互補；采用PCR反向擴增技術(shù)擴增線性化載體以及目的基因；采用連接酶將所述線性化載體與所述目的基因連接，得到環(huán)狀克隆載體；將所述環(huán)狀克隆載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進行表達。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)，尤其涉及一種基于反向擴增全長質(zhì)粒和In-fusion連接的快速克隆方法。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的基因克隆技術(shù)始于70年代初期，包括一系列技術(shù)，主要包括載體選擇、目的DNA片段的獲得、體外重組、導(dǎo)入受體細(xì)胞及陽性克隆篩選等步驟。該技術(shù)實施過程中需要根據(jù)載體選擇合適的酶切位點，根據(jù)已知序列設(shè)計相應(yīng)的引物，從基因組DNA或cDNA中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)獲得目的基因，并使得載體與目的基因用相同的限制性內(nèi)切酶酶切后，在體外通過T4DNA連接酶的作用形成重組體，繼而因載體DNA分子上具有能被原核宿主細(xì)胞識別的復(fù)制起始位點，因此可以在原核細(xì)胞如大腸桿菌中復(fù)制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，獲得大量同一的重組DNA分子，最后通過PCR或者限制性內(nèi)切酶酶切法等手段鑒定目的基因大小，獲得的陽性克隆經(jīng)基因測序分析，最終確認(rèn)目的基因。

近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，諸多公司發(fā)展了一系列商業(yè)性克隆手段，如由Invitrogen公司(San Diego，CA)發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒TA克隆系統(tǒng)，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。TA克隆系統(tǒng)的原理為：利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(MCS)中。如TAKARA公司開發(fā)的In-Fusion克隆試劑盒，利用PCR產(chǎn)物和線性載體末端的15bp重疊序列，In-Fusion酶可以高效準(zhǔn)確地將PCR產(chǎn)物和線性載體融合在一起。可以通過設(shè)計引物來擴增得到15bp重疊序列。該方法無需亞克隆即可將單片段或多片段克隆到單一載體，可將任一PCR片段或多個片段方向性、無縫地克隆到任何線性載體上。而隨著基因定向進化的諸多需求，人們也大力發(fā)展了定點突變基因克隆手段，如Stratagene公司開發(fā)的定點突變試劑盒，就是基因在突變位點設(shè)計一對引物，通過反向擴增全長質(zhì)粒獲得目的基因，通過DpnⅠ限制性內(nèi)切酶消化受甲基化保護的原模板，無需任何純化步驟，即可直接進行體外導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩選陽性克隆，該方法大大縮短了克隆時間，并實現(xiàn)了高陽性克隆率。TAKARA公司的In-fusion克隆方法，雖然簡化了連接時間，但在克隆上仍需使用多輪PCR或者重疊延伸PCR獲得目的片段，而載體的線性化必須依賴限制性內(nèi)切酶進行酶切，工藝仍然較為繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于反向擴增全長質(zhì)粒和In-fusion連接的快速克隆方法，旨在解決傳統(tǒng)基因克隆技術(shù)中須依賴PCR、酶切、連接及轉(zhuǎn)化等多個繁瑣手段，且獲得的陽性率往往較低的問題。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供一種快速克隆方法，包括以下步驟：

設(shè)計用于擴增目的基因的第一引物對和用于擴增載體模板的第二引物對；其中，所述第一引物對包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物包括末端重疊序列A，第一下游引物包括末端重疊序列B；所述第二引物對包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物包括末端重疊序列B’，第一下游引物包括末端重疊序列A’，且所述末端重疊序列A與所述末端重疊序列A’反向互補，所述末端重疊序列B與所述末端重疊序列B’反向互補；