[發明專利]篩選蛋白酶變體的方法以及獲得的蛋白酶變體

有效

• 申請號: 201811540344.6
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN111019925B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 劉日魁;鄒曉龍;萬江華
• 申請（專利權）人: 上饒市康可得生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C07K19/00;C12N15/57;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 賈靜環

本發明涉及篩選蛋白酶變體的方法以及獲得的蛋白酶變體，所述蛋白酶變體具有特殊性能。

本申請要求2018年10月10日提交的、發明名稱“TEV蛋白酶變體、其融合蛋白及制備方法和用途”的中國發明專利申請No.201811177105.9的優先權權益。

技術領域

本發明涉及蛋白質領域，具體地涉及篩選TEV蛋白酶變體的方法以及TEV蛋白酶變體。

背景技術

TEV蛋白酶(TEV Protease)是來源于煙草蝕紋病毒(TEV)的Nla蛋白酶中27kDa的活性結構域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。TEV蛋白酶具有很強的位點特異性，能夠識別EXXYXQ(G/S)七氨基酸序列，最常用序列的是Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(或ENLYFQG)，其切割位點在谷氨酰胺Gln(P1)和甘氨酸Gly(P1′)之間(即P1和P1’之間)，其序列專一性遠比凝血酶、因子Xa、腸激酶等蛋白酶高。

TEV蛋白酶能夠耐受范圍廣泛的pH(pH 4-8.5)和溫度(4-34℃)，對一些常見的增加蛋白可溶性或穩定性的添加劑(乙二醇、EGTA、去垢劑以及還原劑)也都有不同程度的耐受。有研究證明，TEV蛋白酶對乙二醇、EGTA和一些除垢劑(Triton X-100、Tween-20和NP-40)不敏感，當1％CHAPS存在時活性降低，在低濃度變性劑(2M尿素,1％SDS)和還原劑(0.7Mβ-巰基乙醇)中依舊可以保持大部分活性(C.Sun et al.,2012)。

野生型TEV酶在表達和溶解性等方面存在一定的缺陷，所以通過基因工程技術改良的突變體有大量報道。例如，天然的TEV蛋白酶會發生自我切割，在表達和純化過程中，它會不斷由于其它TEV蛋白酶的碰撞而發生構象變化，在特定位點發生自我切割，從而使完整的蛋白酶被截短，活性大大降低。Lucast等人找到的S219N突變體，穩定性得到很大的提高，但是可溶性并不高，有大約95％的蛋白是以包涵體的形式存在于沉淀中。Kapust等人使用基因工程點突變了天然TEV蛋白酶的基因序列，得到S219V這一穩定性較高并且酶活性也有稍微提高的突變體，其穩定性比S219N要高出約100倍。其次，TEV蛋白酶表達產量不高，溶解度也非常低。大約只有5％的TEV蛋白酶存在于細胞破碎液的上清中，產量為12.5mg/L。Vanden Berg等人通過基因改組(DNA shuffling)、易錯PCR(error-prone PCR)發現了一種可以將產量提高到54mg/L的突變體TEVSH，其溶解度比S219N有很大提高，并且酶活性變化不大。Cabrita，L.D.等人使用PoPMuSiC軟件設計，對TEV蛋白酶單點突變體進行穩定性分析，篩選出了五個突變體，它們的可溶性和酶活性相對于野生型TEV蛋白酶都得到提升，同時還得到一個雙突變體，其可溶性及酶活性相對于單突變體有顯著提高。針對TEV蛋白酶本身的缺點，研究者一直在尋找改良的突變體。例如，TEV Ser135Gly突變體比WT更穩定，可以耐受對更高的溫度(40℃)；還有一些突變(T17S，N68D，N177V)可以顯著提高TEV蛋白酶的溶解性。

目前TEV蛋白酶的篩選方法主要關注提高TEV蛋白酶的酶活性、溶解度和產量等性質。尚未報道如本申請的TEV蛋白酶的篩選方法。

發明內容

本發明至少部分基于發明人在多肽藥物生產過程中的發現：目前常規的TEV蛋白酶會在表達過程中大量切割融合蛋白(自我酶切)，導致多肽被提前釋放，容易被胞內蛋白酶水解，不利于純化，不適合工業化生產；常規TEV蛋白酶雖然在低濃度變性劑中(2M尿素,1％SDS)依舊可以保持大部分活性(C.Sun et al.,2012)，但是有很多蛋白在2M尿素等低濃度變性條件下往往是不能完全溶解的，這就限制了TEV蛋白酶的使用。對此，發明人提供了以下新的篩選方法來尋找適合于解決該問題的TEV蛋白酶變體。

本發明提供了篩選蛋白酶變體的方法，其包括以下步驟：

(1)構建蛋白酶隨機突變文庫，優選蛋白酶隨機突變病毒文庫，優選蛋白酶隨機突變噬菌體文庫；