[發(fā)明專(zhuān)利]篩選蛋白酶變體的方法以及獲得的蛋白酶變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811540344.6
• 申請(qǐng)日: 2018-12-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111019925B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉日魁;鄒曉龍;萬(wàn)江華
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上饒市康可得生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/50
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/50;C07K19/00;C12N15/57;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 賈靜環(huán)

1.篩選蛋白酶變體的方法，其包括以下步驟：

(1) 構(gòu)建蛋白酶隨機(jī)突變文庫(kù)；

(2) 對(duì)所述蛋白酶隨機(jī)突變文庫(kù)篩選在宿主內(nèi)蛋白酶酶切活性弱且在體外變性條件下有蛋白酶酶切活性的蛋白酶變體；所述體外變性條件是3M-5M尿素或1M-2M鹽酸胍；

其中所述蛋白酶是TEV蛋白酶；其中TEV蛋白酶變體與以SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的S219V蛋白酶相比在宿主內(nèi)具有更低的酶切活性且在體外變性條件下保留以SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列的S219V蛋白酶的酶切活性；

其中所述蛋白酶隨機(jī)突變文庫(kù)是蛋白酶隨機(jī)突變噬菌體文庫(kù)；

在步驟(1)中以SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的S219V TEV蛋白酶為模板進(jìn)行隨機(jī)突變來(lái)構(gòu)建所述文庫(kù)；

其中以Avi-蛋白酶-蛋白酶切割位點(diǎn)-Y1-PIII構(gòu)建體將蛋白酶展示于噬菌體PIII蛋白末端，其中Avi標(biāo)簽是由15個(gè)氨基酸殘基GLNDIFEAQKIEWHE組成的短肽標(biāo)簽，其中Y1是感興趣的蛋白質(zhì)；

其中所述篩選包括在宿主內(nèi)將所述蛋白酶隨機(jī)突變噬菌體文庫(kù)生物素化；

其中所述篩選包括用鏈霉親合素磁珠處理經(jīng)生物素化的噬菌體文庫(kù)，將被磁珠捕獲的噬菌體置于4M以上尿素中孵育一段時(shí)間，并且分離磁珠與含有目的噬菌體的溶液；其中對(duì)所述目的噬菌體重復(fù)篩選一次或多次；

其中所述宿主是大腸桿菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括表征蛋白酶變體的步驟。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括使用隨機(jī)突變?cè)噭┖挟a(chǎn)生所述突變文庫(kù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述TEV蛋白酶切割序列是EXXYXQG、EXXYXQS或EXXYXQH，其中X為任意氨基酸殘基。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述TEV蛋白酶切割序列選自SEQ ID NO: 7和8。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述構(gòu)建體是pHEN1-Avi-TEVp-sTEV-Y1。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶切活性是對(duì)包含所述蛋白酶及其切割序列測(cè)定的。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述酶切活性是對(duì)蛋白酶-蛋白酶切割序列-Y1測(cè)定的。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述酶切活性是對(duì)包含所述TEV蛋白酶變體及其切割序列的融合蛋白測(cè)定的。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中融合蛋白是TEVp-sTEV-Y1。

11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中通過(guò)菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證所述文庫(kù)。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述菌落PCR使用的引物為：上游引物: 5’- CCACCATGGCCGGTCTGAATGATATTTTTGAAGC -3’

下游引物：5’- TTGTTCTGCGGCCGCAAATTCCAGC -3’。

13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中文庫(kù)容量達(dá)到1x10⁹以上。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中文庫(kù)容量達(dá)到2x10⁹。

15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中整體突變頻率為中低程度1.5-7個(gè)/kb。

16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中Y1是人或豬ACTH或GLP-1。