[發明專利]用于檢測碳青霉烯類耐藥基因NDM1-24亞型的LAMP引物組合及其應用

在審

• 申請號: 201811540106.5
• 申請日: 2018-12-17
• 公開（公告）號: CN109628616A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 張巖;陳燕旌;邢婉麗;高占成;程京
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司;北京大學人民醫院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理事務所(普通合伙) 11710
• 代理人: 姚金金

本發明涉及生物技術領域，具體公開了用于檢測碳青霉烯類耐藥基因NDM1?24亞型的LAMP引物組合及其應用。本發明經篩選得到靈敏度高、特異性強、重復性好的LAMP引物組合，由外引物?F3、外引物?B3、內引物?FIP、內引物?BIP、環引物?LF和環引物?LB組成，其分別為含有SEQ ID NO.1～6所示序列的核苷酸序列。利用本發明提供的LAMP引物組合檢測碳青霉烯類耐藥基因NDM，具有準確率高、特異性好、檢測時間短、結果可實時觀測的特點，從樣品處理到報告結果只需1.5h的快速簡便且后期可能用于現場實時檢測。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及用于檢測碳青霉烯類耐藥基因NDM1-24亞型的LAMP引物組合及其應用。

背景技術

抗菌藥物是臨床應用最廣泛的一類藥物。近年來，感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素濫用，耐藥菌帶來的用藥困難。我國是抗生素濫用情況最為嚴重的國家之一，隨著抗生素使用量的加大，細菌耐藥的情況也越發嚴重。抗生素種類繁多，作用機制多樣。

碳青霉烯類抗菌藥物如亞胺培南、美羅培南等具有抗菌譜廣、抗菌作用強、對多種β-內酰胺酶高度穩定的特點，尤其在治療耐藥革蘭陰性菌感染中具有極其重要的地位。但近年來銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希菌、產酸克雷伯菌、鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率迅速上升。2009年，英國卡迪夫大學TimothyR.Walsh教授研究團隊在肺炎克雷伯桿菌中首次發現了一種新型金屬β-內酰胺酶，該酶可以水解除氨曲南以外的所有β-內酰胺類藥物，介導菌株對碳青霉烯類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素的耐受。由于該菌株分離自曾在印度首都新德里接受治療的患者，于是研究者將這一新型金屬β-內酰胺酶命名為新德里金屬β-內酰胺酶(NewDelhimetallo-β-lactamase1)，即NDM-1，同時以blaNDM-1命名編碼NDM-1的基因，攜帶有blaNDM-1基因的菌株被稱為“NDM超級耐藥菌”。因此，“NDM超級耐藥菌”并不是一種細菌，而是指一類細菌。任何一種細菌在獲得能表達blaNDM-1基因后，可以使碳氫霉烯類和其他滭內胺抗生素如青霉素失去功效。含有NDM基因的細菌通常會對多種抗菌藥物呈抗藥性，限制治療方法，并導致嚴重的臨床感染，難以治理給臨床感染治療帶來很大困難。

常見檢測細菌耐藥基因的方法主要有：聚合酶鏈式反應、PCR-限制性片段長度多態性分析、PCR-單鏈構象多態性分析、生物芯片技術、自動DNA測序等。傳統的基因鑒定方法為PCR法和DNA測序法，其中傳統的PCR法檢測周期較長，通常需要3-4個小時；SangerDNA測序法對引物特異性要求較高，且價格較昂貴，后期數據分析較復雜，不適合臨床推廣使用。

環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環的鏈置換核酸擴增反應。LAMP針對靶序列的6個區域設計4條特異引物，利用具備鏈置換功能的DNA聚合酶在恒定溫度下不斷復制擴增DNA。為了提高反應效率，可在反應體系中添加兩條環引物，使之分別與莖環結構結合，啟動鏈置換合成，循環復制。

LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優勢，尤其適合在基層開展LAMP試劑盒的應用推廣。LAMP技術中，引物是決定檢測結果靈敏度和特異性的關鍵因素。

公開號為CN102242210A的中國專利申請公開了環介導等溫擴增超級細菌NDM-1基因的引物及檢測超級細菌NDM-1基因的試劑盒及檢測方法，公開號為CN102242197A的中國專利申請公開了用于檢測NDM-1基因的LAMP試劑盒及其專用引物，公開號為CN103614465A的中國專利申請公開了用于檢測革蘭陰性桿菌常見碳青霉烯酶基因的LAMP引物、試劑盒及其檢測方法。然而，這些方法均為NDM-1的檢測。目前，尚未見使用環介導等溫核酸擴增技術檢測碳青霉烯類耐藥基因NDM所有亞型(已知的1-24亞型)的報道，更無合適高效的引物用于該領域的LAMP檢測。

發明內容