[發明專利]一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201811534396.2
• 申請日: 2018-12-14
• 公開（公告）號: CN109576299A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 李俊香;古勤生
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 鄭州紅元帥專利代理事務所(普通合伙) 41117
• 代理人: 楊妙琴

本發明提供了一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，包括如下步驟：（1）多主棒孢對潮霉素的敏感性測定；（2）抗生素抑制農桿菌正常生長的濃度篩選；（3）多主棒孢分生孢子懸浮液制備；（4）含雙元載體根癌農桿菌菌液制備；（5）根癌農桿菌與多主棒孢分生孢子共培養；（6）轉化子的篩選；（7）轉化子的分子鑒定，插入拷貝數以及遺傳穩定性分析。本發明不需要去除真菌細胞壁制備原生質體，操作簡單，轉化效率高，并且得到的轉化子單拷貝比例大，能夠穩定遺傳。本發明提供了一套穩定高效的根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，為獲得致病突變體提供潛在可能，為深入研究致病相關基因及致病機制奠定基礎。

技術領域

本發明涉及一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，屬于基因工程領域。

背景技術

多主棒孢是一種重要的植物病原菌，寄主范圍廣泛。該病原菌常常危害植物葉部形成靶狀病斑，也可侵染寄主的花、果實、莖和根。然而，有關多主棒孢致病遺傳機制仍不清楚，鑒于多主棒孢葉斑病在作物上的經濟重要性，發展新的策略，提供新的方法，在分子水平上深入研究致病相關基因和致病機制勢在必行。

真菌轉化技術以隨機或靶向模式破壞基因而產生突變體，這為在分子水平上深入研究真菌致病相關基因提供了突變體材料。目前絲狀真菌中使用最多的遺傳轉化方法有原生質體介導的遺傳轉化（PEG），限制性內切酶介導的遺傳轉化（REMI）以及根癌農桿菌介導的遺傳轉化（ATMT）。在這些轉化方法中，因為ATMT技術避免了PEG和REMI轉化技術的一些缺點而著漸成為真菌中研究基因功能的重要方法。首先，ATMT技術與PEG技術不同，不需要去除真菌細胞壁制備原生質體，而原生質體的制備是一個復雜的過程。ATMT技術優于其他轉化方法的第二個突出特點是，T-DNA可以隨機的插入到基因組中且通常以單拷貝插入的形式整合到基因組中，所以，任何一個表型改變的突變體都很可能是由于插入引起的。通過篩選T-DNA插入突變體庫，獲得表型突變體，然后擴增T-DNA插入位點側翼序列，辨別受影響的基因。

目前有很多關于ATMT 在不同真菌中成功轉化的例子，并且也證實該轉化技術在靶標基因的刪除和破壞方面非常有效。然而，不同真菌遺傳轉化所需的條件不同，轉化參數存在差異，影響因素有所不同。到目前為止，沒有關于根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化研究的報道，參照其他絲狀真菌的轉化方法無法順利進行轉化。

發明內容

本發明的目的是提供一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，通過該方法可得到T-DNA插入菌株，可以通過篩選T-DNA插入突變體庫，獲得表型突變體，再對其進行致病性試驗，評價其致病能力。對致病能力變異的突變體研究其T-DNA插入拷貝數，擴增插入位點側翼序列，再通過相關數據庫及分子生物學軟件來辨別受影響的基因。本發明為獲得致病突變體提供潛在可能，為深入研究致病基因及致病機制奠定基礎。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，包括以下步驟：

（1）多主棒孢對潮霉素的敏感性測定：在含不同濃度潮霉素的PDA平板上接種多主棒孢，培養觀察菌落生長情況，確定潮霉素（hph）最佳使用濃度；

（2）抗生素抑制根癌農桿菌正常生長的濃度篩選：挑取農桿菌單克隆活化擴大培養后，收集菌體稀釋均勻涂布于含不同濃度頭孢霉素和特美汀的平板上，培養觀察，確定抗生素最佳使用濃度；

（3）多主棒孢分生孢子懸浮液制備：用誘導培養基洗脫平板上的多主棒孢分生孢子，調節孢子濃度為1×10^5-6 個/ mL；

（4）含雙元載體根癌農桿菌菌液制備：挑取農桿菌單克隆活化培養后，用誘導培養基稀釋，再培養5～6h使得OD₆₀₀達到0.5～0.6；