[發明專利]一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201811534396.2
• 申請日: 2018-12-14
• 公開（公告）號: CN109576299A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 李俊香;古勤生
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 鄭州紅元帥專利代理事務所(普通合伙) 41117
• 代理人: 楊妙琴

1.一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）多主棒孢對潮霉素的敏感性測定：在含不同濃度潮霉素的PDA平板上接種多主棒孢，培養觀察菌落生長情況，確定潮霉素最佳使用濃度；

（2）抗生素抑制根癌農桿菌正常生長的濃度篩選：挑取農桿菌單克隆活化擴大培養后，收集菌體稀釋均勻涂布于含不同濃度頭孢霉素和特美汀的平板上，培養觀察，確定抗生素最佳使用濃度；

（3）多主棒孢分生孢子懸浮液制備：在培養好的平板菌落上加5mL IM液體培養基洗脫平板上的多主棒孢分生孢子，再用滅菌的毛筆掃落孢子，然后三層擦鏡紙過濾獲得孢子懸浮液，調節孢子濃度為1×10^5-6 個/ mL；

（4）含雙元載體根癌農桿菌菌液制備：將含有雙元載體的農桿菌劃線接種于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的固體LB平板上，黑暗培養2d，挑取單菌落到5mL含50μg/mLKan和25μg/mL Rif的LB液體培養基，振蕩培養過夜，取1.5mL菌液，離心去上清，用IM培養基清洗2次，再用1mL IM懸浮菌體，取少量菌液于5mL含AS的IM液體培養基，振蕩培養5～6h使得OD600達到0.5～0.6；

（5）根癌農桿菌與多主棒孢共培養：將孔徑為0.45μm，大小為4cm×5cm的無菌硝酸纖維素膜平鋪到含AS的CM培養基上；將準備好的農桿菌和孢子懸浮液等體積混合均勻，取200μL混合液均勻涂布在硝酸纖維素膜上，22-25℃黑暗培養不少于48h；

（6）轉化子的篩選：根癌農桿菌與多主棒孢分生孢子共培養后將CM平板上的硝酸纖維素膜剪成細條狀，并翻轉平鋪到篩選平板上，25℃黑暗培養，直至菌落出現，能長出的菌落初步確定為轉化子；將長出的單菌落分別轉接到新的含選擇壓力的平板上培養至菌絲鋪滿平板，用于分子檢測；

（7）轉化子的PCR鑒定，插入拷貝數以及遺傳穩定性分析：將上述轉化子進行潮霉素磷酸轉移酶基因的PCR驗證，確定這些假定的轉化子是不是真正的轉化子，然后進行Southernblot 試驗，分析其插入拷貝數，最后，檢測這些轉化子的遺傳穩定性。

2.根據權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（1）中潮霉素濃度為100 μg/ mL。

3.根據權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（1）中菌體稀釋至OD₆₀₀為0.5時均勻涂布。

4.根據權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（2）抗生素濃度為400μg/mL Cef+200μg/mL Tim。

5.根據權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于：所述的步驟（3）的分生孢子濃度為1×10⁶ 個/ mL。

6.根據權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（4）所用的根癌農桿菌濃度OD₆₀₀為0.5，IM培養基pH值為5.6。

7.根據權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于：所述步驟（5）所用的乙酰丁香酮濃度為200μM，CM培養基pH值為5.6，共培養溫度為23℃，共培養時間為54-72h。

8.根據權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導的多主棒孢遺傳轉化方法，其特征在于：所述的步驟（6）中硝酸纖維素膜剪成1cm×4cm大小，培養時間為5-7d，篩選培養基為PDA+100μg/mL hph+400μg/mL Cef+200μg/mL Tim。