[發明專利]麥芽糖轉錄激活因子MalR的突變體文庫構建篩選及其應用

有效

• 申請號: 201811532883.5
• 申請日: 2018-12-14
• 公開（公告）號: CN110592131B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 張大偉;付剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C40B50/06;C07K14/32
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發明提供了一種以芽孢桿菌為出發菌株，利用熒光蛋白快速構建篩選麥芽糖轉錄激活因子MalR突變庫的方法，同時篩選獲得可降低麥芽糖啟動子滲漏表達并提高其誘導表達強度的啟動子突變體，從而有利于麥芽糖啟動子在蛋白表達中的應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及麥芽糖轉錄激活因子MalR突變體，該突變體獲得方法及應用。

背景技術

多肽及重組蛋白的異源表達生產在蛋白質工程中具有重要的意義，其中利用原核生物進行多肽及重組蛋白的大規模生產具有蛋白表達量高、發酵密度大、發酵成本低廉等優勢。

枯草芽孢桿菌啟動子是實現基因高效表達的關鍵元件之一。近年來，在啟動子的研究方面開展了大量的工作并取得了長足的進展，克隆獲得了一批可以應用于枯草芽孢桿菌的啟動子。但是，枯草芽孢桿菌的現有啟動子在數量、表達量和調控方式等方面存在著諸多問題。需要進一步研究和完善，獲得更多表達強度高，誘導調控方便的啟動子元件。在枯草芽孢桿菌中常用的啟動子系統有Pspac、Pxyl和PsacB系統，這三個啟動子系統在枯草桿菌研究工作中應用很廣，但它們也有自己的缺點：Pspac啟動子的誘導物IPTG不僅成本高，而且有毒性；Pxyl啟動子的誘導物木糖價格高，易增加生產成本；PsacB啟動子的表達量相對較低，這些缺陷使得它們在工業生產中有一定的局限性。目前，針對枯草芽孢桿菌中麥芽糖啟動子表達系統及其優化亦有相關的研究，麥芽糖啟動子表達系統的誘導物成本相對較低，然而如何進一步提高其表達水平仍在不斷深入探索和研究。

目前針對麥芽糖啟動子表達強度優化的改造策略主要集中于啟動子序列上，特別是針對啟動子核心區域如-35區、10區的突變篩選。然而上述改造策略常常無法兼顧表達強度和表達嚴謹性，即在提高啟動子表達水平的同時存在較為嚴重的滲漏表達情況。

因此，為進一步提高麥芽糖啟動子工業利用能力，仍有待進一步提高其轉錄水平，表達水平，同時降低其滲漏表達水平。

麥芽糖操縱子的轉錄過程是由結構基因上游的PmalA啟動子控制，該操縱子包括三個結構基因malA、malR、malP，malR基因編碼的轉錄激活因子MalR可通過結合磷酸化的麥芽糖而被激活，激活后的MalR的N末端與麥芽糖啟動子序列結合，促進了該啟動子的轉錄表達，起到了正向調控的作用。因此，針對麥芽糖啟動子的轉錄激活因子MalR進行突變改造預計可以有效提高啟動子的轉錄激活效應，同時也可兼顧表達嚴謹性。

發明內容

為了解決上述問題，本發明以芽孢桿菌為出發菌株，通過構建麥芽糖轉錄激活因子MalR突變庫，獲得可降低麥芽糖啟動子滲漏表達并提高其誘導表達強度的突變體，從而有利于麥芽糖啟動子在蛋白表達中的應用。

第一方面，本發明提供了一種降低麥芽糖啟動子滲漏表達并提高其誘導表達強度的方法，所述方法包括以下步驟：

1).在出發菌株中敲除麥芽糖轉錄激活因子MalR；

2).構建含有麥芽糖啟動子PmalA，受麥芽糖啟動子PmalA調控的蛋白基因，啟動子HpaII以及受HpaII調控的麥芽糖轉錄激活因子MalR基因的載體；

3).對步驟2)所構建載體的麥芽糖轉錄激活因子MalR基因進行基因突變，構建獲得MalR突變體文庫；

4).將步驟3)構建獲得的MalR突變體文庫轉化步驟1所構建的菌株；

5).對步驟4)所獲得的菌株進行培養，篩選獲得麥芽糖啟動子滲漏表達降低同時誘導表達強度提高的MalR突變體。

步驟1所述出發菌株為為芽孢桿菌；優選地，為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌；更優選地，為枯草芽孢桿菌。

步驟2所述受麥芽糖啟動子PmalA調控的蛋白為熒光蛋白，優選地，所述熒光蛋白為綠色熒光蛋白GFP。所述麥芽糖轉錄激活因子MalR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。