[發明專利]一種鑒定鮈亞科魚類的方法

在審

• 申請號: 201811526529.1
• 申請日: 2018-12-13
• 公開（公告）號: CN109536618A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 周傳江;楊長幸;汪曦;王先鋒;馬文文;馮夢霞;顧錢洪;聶國興
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.一種鑒定鮈亞科魚類的引物，其特征在于，所述引物序列為：

F：5’-TACCTGTGGCAATTACRCGCTGAT-3’；SEQ ID NO：1；

R：5’-TAAGARTAAAATGGTCCYAAACC-3’；SEQ ID NO：2；

其中，R代表A或者G；Y代表C或者T。

2.一種鑒定鮈亞科魚類的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)確定鮈亞科魚類的特異性引物：

①根據鮈亞科不同種魚類線粒體COI基因序列，選取不同序列之間的保守片段；

②根據步驟①選取的保守片段，設計并篩選出鮈亞科魚類的特異性引物；

③利用步驟②獲取的特異性引物，對鮈亞科魚類及其他魚類的基因組DNA進行PCR擴增，獲得擴增產物；

④將步驟③獲得的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，鮈亞科魚類能夠擴增出條帶；回收條帶，進行測序；

⑤將步驟④測序所得序列進行比對，下載相似度高及其近緣種序列，構建系統發育樹，計算遺傳距離，當序列間遺傳距離小于0.02時，初步確定該序列為鮈亞科魚類序列，從而確定鮈亞科魚類的特異性引物；

(2)鑒定鮈亞科魚類：

①利用步驟(1)獲得的特異性引物，對需要鑒別的魚類DNA樣本進行PCR擴增，獲得擴增產物；

②將步驟①獲得的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得目的條帶，回收目的條帶，進行測序；

③將步驟②測序所得序列進行比對，下載相似度高及其近緣種序列，構建系統發育樹，計算遺傳距離；

④根據步驟③獲得的遺傳距離鑒定鮈亞科魚類。

3.根據權利要求2所述的一種鑒定鮈亞科魚類的方法，其特征在于，所述鮈亞科魚類為多紋頜須鮈、點紋銀鮈、犬首鮈、長體小鰾鮈、樂山小鰾鮈或中間銀鮈等鮈亞科魚類代表種。

4.根據權利要求3所述的一種鑒定鮈亞科魚類的方法，其特征在于，所述魚類基因組DNA的提取方法如下：取在55℃條件下烘干4h的酒精浸泡的魚類組織或新鮮的魚類組織，置于1.5ml離心管，加入DNA提取液和蛋白酶K，消化過夜，用酚-氯仿法提取基因組DNA。

5.根據權利要求4所述的一種鑒定鮈亞科魚類的方法，其特征在于，所述魚類組織為魚的肌肉、魚鰭或魚卵。

6.根據權利要求5所述的一種鑒定鮈亞科魚類的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系為：DNA模板1μL，上下游引物(F,R)各1.5μL，ddH₂O 11μL，Mix 15μL，終反應體系為30μL；所述PCR擴增的反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，循環30次；72℃延伸10min。