[發(fā)明專利]一種鑒定鮈亞科魚類的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811526529.1
• 申請(qǐng)日: 2018-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN109536618A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周傳江;楊長幸;汪曦;王先鋒;馬文文;馮夢霞;顧錢洪;聶國興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發(fā)明公開了一種鑒定鮈亞科魚類的方法，利用從NCBI下載的已發(fā)表鮈亞科線粒體COI序列，比對(duì)并設(shè)計(jì)鮈亞科魚類的特異性COI引物并合成；用特異性引物對(duì)常見的鮈亞科魚類DNA樣本分別進(jìn)行擴(kuò)增；根據(jù)PCR產(chǎn)物確認(rèn)得到目的長度電泳條帶，條帶經(jīng)純化回收測序，之后對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確認(rèn)獲得鮈亞科魚類的COI序列；依據(jù)產(chǎn)物的測序結(jié)果和已發(fā)表相近物種和同種序列比對(duì)，并構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹，同時(shí)通過MEGA軟件估算已知物種和欲鑒定物種之間的遺傳距離，同時(shí)結(jié)合形態(tài)特征進(jìn)一步確認(rèn)分子鑒定結(jié)果的可靠性。本發(fā)明公開的鑒定鮈亞科魚類的方法，具有檢測速度快，識(shí)別精確度高，通量高，人為影響小等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種鑒定鮈亞科魚類的方法。

背景技術(shù)

魚類是人類的伙伴，為人類提供了許多人體所必須的元素和物質(zhì)，也是人類食物來源之一，因而保護(hù)魚類的多樣性，變得越來越重要。

鮈亞科魚類生活在江河小支流和池塘等小水體中，棲息條件為靜水或微流水環(huán)境的淺水地帶，喜棲息于水體的中、下層，主要分布于各水系，生殖期為5月，主要攝食水生昆蟲，其次為藻類和水生高等植物。但部分種分布區(qū)窄，為分布地特有種，其數(shù)量甚稀少，為臨近瀕危的偶見種類。

目前，魚類鑒別的主要方法仍然是傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法，根據(jù)魚體的形態(tài)特征，對(duì)魚的種類進(jìn)行鑒定，但在不同來源的動(dòng)物志及魚類志中缺乏統(tǒng)一的鑒定特征或者是鑒別征存在中間類型而難于區(qū)分。且該種方法需要大量的工作經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也需要豐富的專業(yè)知識(shí)，對(duì)于魚體的完整性要求也比較高。對(duì)于一些體型較小的魚類或者身體被破壞的魚類，可能無法進(jìn)行鑒定。因此，提供一種鑒定鮈亞科魚類的分子生物學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種鑒定鮈亞科魚類的特異性引物和方法，該方法具有檢測速度快，識(shí)別精確度高，通量高，人為影響小等優(yōu)點(diǎn)，可用于鮈亞科魚類的分子鑒定。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種鑒定鮈亞科魚類的引物，所述引物序列為：

F：5’-TACCTGTGGCA ATTACRCGCTGAT-3’；SEQ ID NO：1；

R：5’-TAAGARTAAAATGGTCCYAAACC-3’；SEQ ID NO：2；

序列中根據(jù)國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUB)規(guī)定兼并密碼子:R＝A/G；Y＝C/T；R代表A或者G；Y代表C或者T；

F為上游引物序列，R為下游引物序列，F(xiàn)與R形成引物對(duì)，用于鮈亞科魚類的鑒定。

進(jìn)一步，一種鑒定鮈亞科魚類的方法，具體步驟如下：

(1)確定鮈亞科魚類的特異性引物：

①從NCBI數(shù)據(jù)庫下載部分鮈亞科不同種魚類的線粒體COI基因序列，通過不同種鮈亞科魚類的COI序列比對(duì)，選取不同序列之間的保守片段；

②根據(jù)步驟①選取的保守片段，設(shè)計(jì)并篩選出鮈亞科魚類的特異性引物；

③利用步驟②獲取的特異性引物，對(duì)鮈亞科魚類及其他魚類的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

④將步驟③獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鮈亞科魚類能夠擴(kuò)增出條帶，其他魚類不能擴(kuò)增出條帶；回收條帶，進(jìn)行測序；

⑤將步驟④測序所得峰圖文件用LASERGENE軟件包中Seqman軟件組裝為一個(gè)contig文件，用NCBI中的BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)，下載相似度高及其近源種序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，計(jì)算遺傳距離，當(dāng)序列間遺傳距離小于0.02時(shí)，初步確定該序列為鮈亞科魚類序列，從而確定鮈亞科魚類的特異性引物；