[發明專利]循環腫瘤細胞表面標志分子HER2的檢測方法

在審

• 申請號: 201811523965.3
• 申請日: 2018-12-13
• 公開（公告）號: CN109541214A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 錢軍;周麗
• 申請（專利權）人: 錢軍
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/532
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 楊軍

本發明涉及一種循環腫瘤細胞表面標志分子HER2的檢測方法，包括以下步驟：將全血用紅細胞裂解液處理，分離出有核細胞，并用甲醛進行固定；先通過腫瘤免疫熒光標志物細胞角蛋白抗體anti?CK進行陽性篩選，用Her2一抗孵育所有細胞，然后用標記有FITC熒光基團的Her2二抗孵育，再用細胞核熒光染料DAPI標記出所有細胞；采用高通量多色成像分析，選擇CY5、FITC和DAPI的濾光片，觀察通道表面熒光顏色，即實現對循環腫瘤細胞表面標志分子Her2的檢測；本發明同現有技術相比，該檢測方法簡便、快速、經濟，無創，靈敏度高，特異性好，能夠解決現有技術檢測HER2的不足，值得推廣應用。

[技術領域]

本發明屬于分子生物學領域，具體地說是一種循環腫瘤細胞表面標志分子HER2的檢測方法。

[背景技術]

人類表皮生長因子受體2(her-2)是乳腺癌最主要的原癌基因之一，又稱為c-erbB-2基因，定位于人類染色體17q21，編碼分子量為185KD具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白。亞洲有25％的病人從HER2靶向治療中受益。在乳腺癌診治過程中，HER-2是重要的預后指標和靶向HER-2藥物的預測指標，約18％～20％的乳腺癌病人會出現HER-2的過表達，準確分析HER-2狀態是乳腺癌病人預后判斷以及制定有效治療方案的先決條件，對乳腺癌的診療具有重要的指導作用。

目前，檢測HER2的方法主要有ELISA、IHC、FISH、CISH、RT-PCR等，臨床常規的HER-2檢測手段包括免疫組化(IHC)和熒光原位雜交(FISH)。IHC法檢測的是細胞膜上HER-2蛋白的表達情況，而FISH法則是檢測HER2的基因擴增水平。IHC和FISH為美國FDA針對曲妥珠單抗(Herceptin)治療而推薦的用于石蠟組織的檢測方法，FISH法是在Her2探針的基礎上，以17號染色體著絲粒探針(CEP17)作為內參，為目前Her2檢測的“金標準”。

雖然目前HER2的臨床檢測一定程度上滿足了乳腺癌臨床診斷治療的需求，但是隨著臨床治療理念的不斷發展，IHC和FISH的一些不足也成為乳腺癌診療所面臨的新的問題。主要表現在以下方面：

(1)IHC雖然具有檢測成本低、操作簡單、耗時短、可實現自動化檢測和染色后切片便于存檔等優點，但IHC易受到受檢組織固定時間、固定液的選擇、抗體試劑盒的選擇和染色結果判讀的主觀性等諸多因素影響；

(2)FISH方法特異性、穩定性都更高，但FISH價格昂貴、操作步驟繁雜、不能觀察組織形態學且染色后樣本不能長期保存；

(3)如存在一些IHC與FISH均為不確定結果，則無法明確HER2狀態；

(4)腫瘤異質性導致IHC和FISH無法避免假陰性的結果；

(5)部分病人無法提供組織標本，或者組織標本無法滿足檢測的基本要求，另外，檢測所需組織標本要通過手術獲取，取材繁瑣且對患者影響較大；

(6)臨床研究表明，患者病情發展及治療過程中也會發生HER2狀態的變化，IHC和FISH技術都無法對病人進行實時動態監測?；诖耍瑸楦玫闹笇橄侔┗颊叩膫€體化治療，亟需尋找新的檢測方法以便對IHC和FISH結果補充參考，同時也能夠對HER2狀態實時動態監測，及時調整治療方案。

循環腫瘤細胞是由原發灶脫落，進入血循環后，在遠處器官或原發臟器定居，形成轉移灶。循環腫瘤細胞CTC檢測作為液體活檢的熱門領域，在腫瘤診斷、治療和監控等方面的臨床表現已逐漸嶄露頭角，是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段，臨床應用價值極其顯著。

因此，若能提供一種檢測循環腫瘤細胞表面Her2的方法，將具有非常重要的意義。

[發明內容]

本發明的目的就是要解決上述的不足而提供一種循環腫瘤細胞表面標志分子HER2的檢測方法，該檢測方法簡便、快速、經濟，無創，靈敏度高，特異性好，能夠解決現有技術檢測HER2的不足。