[發(fā)明專利]一種維持和恢復(fù)毛乳頭細(xì)胞干性的外泌體制劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811519885.0
• 申請(qǐng)日: 2018-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN109439614B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁博;陳錦陽;劉軍權(quán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江衛(wèi)未生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/0783
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 劉元慧

本發(fā)明公開了一種維持和回復(fù)毛乳頭細(xì)胞干性的外泌體制劑，該制劑通過以下方法制得：1）DPC的分離獲取；2）外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離；3）CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞篩選；4）CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞條件培養(yǎng)基的獲取；5）DPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配置；6）DPC的誘導(dǎo)培養(yǎng)；7）外泌體制劑的制備。該方法避免CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在直接應(yīng)用（細(xì)胞移植）中的免疫排斥和替代方法(transwell)中的共培養(yǎng)成本費(fèi)用高的問題，在DPC培養(yǎng)中能回復(fù)高代次毛乳頭的細(xì)胞干性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維持和回復(fù)毛乳頭細(xì)胞干性的外泌體制劑。

背景技術(shù)

毛乳頭細(xì)胞（DPC）對(duì)毛囊生長(zhǎng)至關(guān)重要，可發(fā)出信號(hào)啟動(dòng)毛囊發(fā)育和毛發(fā)的周期性更替。目前常見的男女脫發(fā)都表現(xiàn)為包括毛乳頭組織在內(nèi)的進(jìn)行性毛囊微型化，導(dǎo)致毛發(fā)生長(zhǎng)周期縮短，毛囊周期紊亂，生長(zhǎng)期縮短，毛發(fā)變稀疏、變短。

目前有研究者分離出對(duì)毛囊再生起關(guān)鍵作用的DPC，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)條件下，代數(shù)較低的較原始的DPC呈聚集性生長(zhǎng)，表達(dá)堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和α-平滑肌蛋白（α-SMA）等特有的標(biāo)記分子。隨傳代次數(shù)增加，ALP和α-SMA的表達(dá)降低，DPC的干性（分化能力）和誘導(dǎo)毛發(fā)發(fā)育及再生的能力或逐漸消失。同時(shí)由于毛囊樣本來源于人體，樣本較難得，已經(jīng)DPC制備獲取過程繁瑣，這就給毛囊部位DPC的研究帶來困難。針對(duì)這一問題，有學(xué)者利用培養(yǎng)過低傳代DPC的條件培養(yǎng)基成分來培養(yǎng)高傳代DPC，發(fā)現(xiàn)其中的Wnt10b等成分可以逆轉(zhuǎn)高傳代DPC的細(xì)胞干性，但對(duì)其中的有效成分進(jìn)行分析獲知，不同批次細(xì)胞間有效成分的表達(dá)水平有差異，實(shí)際應(yīng)用時(shí)效果不穩(wěn)定。

另，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞通過旁分泌Jag1蛋白，上調(diào)毛囊干細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路的表達(dá)，活化在毛囊再生中發(fā)揮中樞作用的DPC（包括WNT信號(hào)通路得激活等），進(jìn)而啟動(dòng)毛囊再生；在毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期前，去除CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞會(huì)阻斷毛發(fā)再生。但想直接通過細(xì)胞移植的方法將T細(xì)胞應(yīng)用在臨床脫發(fā)治療中存在倫理難通過，機(jī)體免疫源性高等方面的問題；而且想通過常規(guī)的共培養(yǎng)方式，如transwell共培養(yǎng)來回復(fù)高傳代DPC的干性，存在著成本極高的問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明設(shè)計(jì)的目的在于提供一種維持和回復(fù)毛乳頭細(xì)胞干性的外泌體制劑。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)：

所述的一種維持和回復(fù)毛乳頭細(xì)胞干性的外泌體制劑，其特征在于該制劑采用以下方法制備和應(yīng)用：

1）DPC的分離獲取，采集患者后枕部區(qū)域單位毛囊組織，采用改良二步酶消化法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室DPC的分離培養(yǎng)；

2）外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離，抽取肝素抗凝靜脈血30mL，取6 個(gè)15mL離心管，每管小心加入淋巴細(xì)胞分離液5mL，將5mL 外周血沿管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液層面之上，2000r/min 20℃離心20min，收集淋巴細(xì)胞層中的淋巴細(xì)胞，PBS 洗滌2次備用；