[發明專利]一種維持和恢復毛乳頭細胞干性的外泌體制劑

有效

• 申請號: 201811519885.0
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109439614B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 袁博;陳錦陽;劉軍權
• 申請（專利權）人: 浙江衛未生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0783
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 劉元慧

1.一種維持和回復毛乳頭細胞干性的外泌體制劑，其特征在于該制劑采用以下方法制備：

1）毛乳頭細胞（DPC）的分離獲取，采集患者后枕部區域單位毛囊組織，采用改良二步酶消化法進行實驗室DPC的分離培養；

2）外周血單個核細胞的分離，抽取肝素抗凝靜脈血30mL，取6 個15mL離心管，每管小心加入淋巴細胞分離液5mL，將5mL 外周血沿管壁緩慢置于淋巴細胞分離液層面之上，2000r/min 20℃離心20min，收集淋巴細胞層中的淋巴細胞，PBS 洗滌2次備用；

3）CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞篩選，MACS 分選上述步驟獲得的外周血單個核細胞進行細胞計數，加PBS洗滌，1200r/min 離心后棄上清，以MACS buffer 90μL/每10⁷個細胞重懸，加入CD4+T 細胞Biotin?Antibody10μL/每10⁷個細胞，混勻，進行第一次孵育，第一次孵育結束后加入20μLAnti?Biotin MicroBeads/每10⁷個細胞，混勻，進行第二次孵育，第二次孵育結束后，以MACS buffer將細胞調整至500μL體積，過LD柱，收集過柱后流下來的細胞懸液為CD4+T 細胞（陰選），將細胞洗滌離心后，以MACS buffer 90μL/每10⁷個細胞重懸，加入CD25MicroBeads，混勻，進行第三次孵育，第三次孵育結束后，加入1-2mL MACS buffer 洗滌離心，傾去上清，重懸至500μL，過MS 柱，把separator移開，放置1mL MACSbuffer于MS 柱上，迅速將細胞打下，收集流下的為CD4+CD25+T細胞（陽選）；

4）CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞條件培養基的獲取，將篩選獲取的CD4+CD25+Treg細胞接種于細胞培養袋，培養15d后，吸取培養基于250ml離心管，800g離心10min，上清液即為CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞條件培養基；

5）DPC誘導培養基的配置，將步驟4）中所獲取的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞條件培養基與DPC培養基混合，所得培養基即為DPC誘導培養基；

6）DPC的誘導培養，待第三代DPC鋪滿率為70%時，換DPC培養基為DPC誘導培養基，培養48h后，更換培養基為DMEM基礎培養基；

7）外泌體制劑的制備，在不含血清的DMEM基礎培養基中培養48h后，收集細胞培養上清液，經超速離心法獲取外泌體；用生理鹽水或DMEM溶解為含DPC外泌體濃度為1*10¹⁰顆粒/ml的溶液，即得外泌體制劑。

2.如權利要求1所述的一種維持和回復毛乳頭細胞干性的外泌體制劑，其特征在于步驟1）中改良二步酶消化法的步驟為：

1）經過手術后的單個毛囊置于毛囊采集液中于4℃環境保存，用含1%的雙抗的PBS溶液清洗毛囊組織2～3次；

2）顯微鏡下用1ml注射器針頭將毛球部組織整個分離出來，將殘留的毛母質清除干凈，用移液槍將組織移至新的含PBS溶液的培養皿中；

3）將PBS清洗一次后加入0.2%膠原酶IV，在37℃溫度下消化1h～2h，間隔10min觀察消化狀態，同時用吸管吹打組織，待有毛乳頭組織周邊的真皮鞘組織全部解離出來后，在顯微鏡下用移液槍挑選出單個毛乳頭組織，放置入一個新的培養皿中；

4）DPC的貼壁培養：將步驟1）中獲得的毛乳頭組織進行貼壁培養：毛乳頭組織在37℃、5%CO₂培養箱中進行貼壁培養，待組織全部貼壁并有細胞爬出后更換培養基，以后每間隔3天更換一次培養基，待細胞生長融合達到80%進行消化收集獲取原代DPC。

3.如權利要求2所述的一種維持和回復毛乳頭細胞干性的外泌體制劑，其特征在于4）中培養基為：基礎培養基+10%胎牛血清+10ng/ml EGF+10ng/mlbFGF。

4.如權利要求1所述的一種維持和回復毛乳頭細胞干性的外泌體制劑，其特征在于步驟3）中第一次孵育、第二次孵育、第三次孵育的溫度均為2-8℃，第一次孵育時間為5min，第二次孵育時間為10mim，第三次孵育時間為15min。

5.如權利要求1所述的一種維持和回復毛乳頭細胞干性的外泌體制劑，其特征在于步驟5）中DPC誘導培養基中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞條件培養基體積占比為30%－70%。