[發明專利]CMPF均相酶免疫檢測試劑盒、制備方法及檢測方法

有效

• 申請號: 201811518946.1
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109765360B
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發明（設計）人: 朱永良;王軼雄;程小龍
• 申請（專利權）人: 杭州博譜醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 11411 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 陳劍聰

1.一種CMPF均相酶免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括試劑R1、試劑R2和標準品溶液，

所述試劑R1由如下組分和含量組成：

磷酸鹽緩沖液 50-200mM，

CMPF抗體 5-500mg/L，

NAD輔酶 1-10mM，

G-6-P-Na2 3-20mM，

表面活性劑 0.01-10g/L，

穩定劑 0.1-0.5g/L；

所述試劑R2由如下組分和含量組成：

磷酸鹽緩沖液 50-200mM，

G6PDH-CMPF偶聯物 5-500U/L，

BSA 0.01-10g/L，

表面活性劑 0.01-10g/L；

所述標準品溶液，其由CMPF與校準品稀釋液梯度稀釋而成，所述標準品稀釋液由如下組分和含量組成：

磷酸鹽緩沖液 0.05-0.2M，

BSA 0.01-10g/L，

穩定劑 0.1-0.5g/L；

其中G6PDH-CMPF偶聯物的制備，包括如下步驟：

稱取100 mgCMPF，用10ml二甲亞楓溶解，10KU葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，溶解于200mlpH7.3，100mM的磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌15分鐘，再加入25 mg水溶性碳二亞胺粉末，室溫避光溫和攪拌180分鐘，裝入透析袋，自由通透分子大小<14KD，置4℃透析，每6小時換液1次，連續6-8次；

用超濾膜包對透析液進行濃縮，濃縮體積至30ml，上G200凝膠層析柱3.0×50cm分離產物，收集G6PDH-CMPF峰，共收集80ml，對純化水透析3次，冷凍干燥，得到4.7KU的G6PDH-CMPF；

其中抗CMPF的特異性鼠源性單克隆IgG型抗體的制備，包括如下步驟：

S1.CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物的制備

將CMPF與載體蛋白質混合，并加入碳二亞胺，在碳二亞胺作用下，CMPF與載體蛋白質進行偶聯反應，然后透析得到CMPF-蛋白質偶聯物；或者載體蛋白質用多聚賴氨酸代替，得到CMPF-多聚賴氨酸偶聯物；

S2.動物免疫

以CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物/次/只小鼠的濃度與等量的完全福氏佐劑混勻，皮下多點注射免疫Balb/c雌性小鼠，第1次與第2次間隔10-14天，以后每次間隔7天，連續5次，第2-5次CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物與等量的不完全福氏佐劑乳化混勻，間隔1周后采用尾靜脈/腹腔注射無菌的CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物，以加強免疫1次，3天后細胞融合；

S3.雜交瘤細胞的制備

取步驟S2免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按體積比1:6在50%PEG的作用下融合，融合細胞先在次黃嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶選擇培養基中，在37℃、5% CO₂及飽和濕度條件下培養，2周后換為次黃嘌呤-胸腺嘧啶培養基，繼續在37℃、5% CO₂及飽和濕度條件下培養；待克隆孔長至1/3-1時，取培養上清液進行抗體檢測篩選；

S4.特異性克隆孔篩選

用50 mM的碳酸鹽緩沖液稀釋CMPF-蛋白質偶聯物至100L/孔包被反應微孔4℃過夜或37℃120 min，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次，用10%小牛血清室溫封閉30min，再加入100μl上述步驟S3培養上清液室溫反應60min，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次，最后再加入1:2000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP室溫反應60min，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液洗滌3次，加入四甲基聯苯氨底物顯色觀察；凡出現明顯藍色反應者為陽性，否則為陰性；保留與CMPF-蛋白質偶聯物有反應的細胞克隆孔，再采用有限稀釋法進行3次克隆篩選，建株的雜交瘤細胞再擴大培養、凍存，用于制備腹水；

S5.腹水的制備和純化

將穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞擴大培養后，以0.5×10⁴-5×10⁵個/只接種到預先用0.5 mL降植烷或液體石蠟致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔，7-12天內觀察，收取腹水，離心后測定效價；經50%飽和硫酸銨沉淀保存或者低溫凍存；腹水采用50%飽和硫酸銨沉淀-正辛酸沉淀，或者用50%飽和硫酸銨沉淀-rProtein A-Sepharose Fast Flow親和層析純化，最后用SDS-PAGE檢測純度，需達到90%，獲得抗CMPF-蛋白質偶聯物特異性單克隆抗體；

其中抗CMPF的兔源性多克隆IgG抗體的制備，包括如下步驟：

S1.CMPF-蛋白質偶聯物或CMPF-多聚賴氨酸偶聯物的制備

將CMPF與載體蛋白質混合，并加入碳二亞胺，在碳二亞胺作用下，CMPF與載體蛋白質進行偶聯反應，然后透析得到CMPF-蛋白質偶聯物；或者載體蛋白質用多聚賴氨酸代替，得到CMPF-多聚賴氨酸偶聯物；

S2.動物免疫

以10 mg CMPF-蛋白質偶聯物/次/只與等量完全福氏佐劑混勻，家兔皮下多點注射免疫，每1-2周1次，連續5次，間隔1周后采用分離頸動脈，收集血液80-120毫升，室溫放置2小時，4℃10000 rpm離心30min，分離收集血清；上述血清再用CMPF-蛋白質偶聯物，親和層析柱純化抗CMPF的特異性IgG型抗體，最后用8% SDS-PAGE檢測純度，需達到90%；獲得兔源性多克隆IgG抗體；

上述純化的兔源性多克隆IgG抗體進一步在pH4.5的50mM醋酸鹽緩沖液中用質量比0.1%的胃蛋白酶切除IgG的Fc'端，37℃反應12小時，然后在調或不調pH值的情況下，用飽和硫酸銨和/或SPA和/或CMPF-蛋白質偶聯物親和層析方法純化F(ab') 2抗體片段；獲得特異性的抗CMPF的F(ab')2特異性抗體片段。