[發明專利]三七根腐病致病菌輪枝鐮刀菌的Real-timePCR檢測引物及方法

有效

• 申請號: 201811517612.2
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109439791B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 劉迪秋;李欣;崔秀明;邱炳玲;張應鵬;李珊
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
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本發明公開了一種三七根腐病致病菌輪枝鐮刀菌的Real?time PCR檢測引物及方法，檢測引物的核苷酸序列為：上游引物Fv?QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’，下游引物Fv?QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’；本發明設計輪枝鐮刀菌的特異性引物，建立標準曲線用于輪枝鐮刀菌的定性定量分子檢測和病害準確診斷；利用本發明能快速準確檢測三七種植土壤以及三七病株中輪枝鐮刀菌的數量動態變化，因而可以為三七土壤處理、根腐病的早期診斷和動態監測以及三七種子、種苗的帶菌分子檢測提供技術支持。

技術領域

本發明涉及一種三七根腐病致病菌輪枝鐮刀菌的Real-time PCR檢測引物及其檢測方法，專用于三七根腐病菌的快速分子檢測，同時可實現田間三七根腐病菌的早期診斷和病菌的監測鑒定，屬于農作物病害的分子生物學檢測技術領域。

背景技術

三七[Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen)]為五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物，其干燥根及根莖入藥，是我國傳統名貴中藥材；其味甘、微苦、性溫，歸肝、胃、大腸經，具有化瘀止血、消腫止痛等作用。研究表明其主要成分有三萜類化合物甾醇類、人參炔三醇、黃酮類、糖類、微量元素和氨基酸等(Dawei L, Jiaqing C, Xiuli B, et al.New dammarane-type triterpenoids from the leaves of Panax notoginseng andtheir protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity . Journal ofGinseng Research , 2014, 38(1): 28-33)。其中，三七總皂苷為其主要的藥用活性成分，在三七中含量約為12%（鄭麗華, 盧昌均, 周志昆. HPLC測定三七總皂苷中5種皂苷的含量及穩定性考察. 中醫藥臨床雜志, 2012, 24(1): 73-75)。三七皂苷是治療心血管疾病的活性成分，也是目前研究較為系統的化學物質，三七皂苷具有擴張冠狀動脈、增加冠狀血流量、降低血小板表面活性、抗動脈粥樣硬化、抑制血小板活化、降低血黏度、黏附和聚集、抗血栓形成等作用(趙鐵夫, 王盛宇, 陳宏. 不停跳冠狀動脈旁路移植術術前應用三七三醇皂苷抗血小板的療效研究. 中國醫藥, 2015, 10 (3): 309-311)。至今為止，已有70余種三萜類皂苷分別從三七的根莖、根塊及花等組織中分離鑒定出來，它們均屬于達瑪烷型四環三萜類。它們具有非常廣闊的應用和開發前景。三七獨特的藥效使得它在民間具有不可替代的地位，也是復方丹參滴丸、云南白藥、血塞通、片仔癀等藥品的主要原料，是我國少有的高附加值藥用經濟植物。

隨著近年來三七產業的快速發展，三七種植面積的逐年增加，三七在大規模生產中面臨的問題也隨之而來，當前制約三七可持續發展的原因有兩個方面：一是連作障礙問題嚴重，在三七的實際生產中適合種植三七的土地日益緊張，需要間隔10-15年以上才能復種，連作障礙大大增加了三七的種植成本。二是沒有優良的新品種，三七種質資源嚴重退化，三七病害種類逐年增大，對三七的大規模生產造成巨大損失(崔秀明, 黃路琦, 等. 中國三七產業現狀及發展對策. 中國中藥雜志，2014, 39 (4): 553-557)。

三七的主要病害是根腐病，主要癥狀為根部腐爛，呈濕腐和干腐兩型，地上部黃萎或青枯，常年損失5%～20%，嚴重的達70%，損失占各種三七病害的70%～85%；(蔣妮, 覃柳燕, 葉云峰. 三七病害研究進展. 南方農業學報, 2011, 42 (9): 1070-1074)。而輪枝鐮刀菌是根腐病的致病菌之一。輪枝鐮刀菌是屬于鐮刀屬的一種真菌，菌絲呈白色長毛狀，生長速度較快，2-3天即可生長成熟（蘭楠. 輪枝鐮刀菌velvet復合物生物學功能及粗糙脈孢菌有性發育分子調控機制的研究, [學位論文] 2013- 中國科學院大學: 微生物學）。