[發明專利]三七根腐病致病菌輪枝鐮刀菌的Real-timePCR檢測引物及方法

有效

• 申請號: 201811517612.2
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109439791B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 劉迪秋;李欣;崔秀明;邱炳玲;張應鵬;李珊
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/77
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• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測三七中根腐病致病菌輪枝鐮刀菌的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）提取三七樣品或土壤的DNA；

（2）以提取DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，擴增程序為95℃ 2 min，然后進行45個循環反應，每個循環反應為95℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 1 min，于72℃ 時測定熒光值，每個循環結束后收集并記錄熒光信號；

（3）實時熒光定量PCR標準曲線的建立

制備濃度在0.004ng/μL～40ng/μL范圍內的重組質粒pGEM-T-FvBlh溶液，對不同濃度的溶液進行實時熒光定量PCR反應，擴增程序同步驟（2），于72℃時測定熒光值，每個循環反應結束后收集并記錄熒光信號，以各梯度濃度對應的質粒質量對數值作為縱坐標，Ct值為橫坐標，得到線性回歸方程，并建立標準曲線；

（4）若出現熒光信號則可判定所檢測樣品中存在根腐病致病菌輪枝鐮刀菌，并將獲得的Ct值帶入構建的標準曲線中，計算得到檢測樣品中輪枝鐮刀菌的數量；

實時熒光定量PCR的反應體系為20μL，其包含2×SYBR Green Mix 10μL、無核酸酶水7μL、上游引物Fv-QF 1 μL，下游引物Fv-QR 1 μL、DNA模板1μL；

上游引物Fv-QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’

下游引物Fv-QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：上游引物Fv-QF和下游引物Fv-QR的濃度均為2μmol/L。