[發明專利]一種基因工程菌制備2-巖藻糖基乳糖的方法

有效

• 申請號: 201811516891.0
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109554385B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 吳志剛;周曉雷;鄒衛
• 申請（專利權）人: 石家莊葛蘭德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 陸金星

本發明提供了一種基因工程菌，是在原始菌株基礎上通過敲除和/或增強與2?巖藻糖基乳糖代謝途徑有關的基因獲得的。該基因工程菌能夠更好地積累體內高濃度的乳糖和GDP?Fuc，進而能夠提高終產物2?巖藻糖基乳糖的產量。本發明還提供了利用該基因工程菌生產2?巖藻糖基乳糖的方法和應用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體來說，涉及一種關于2-巖藻糖基乳糖生產的基因工程菌及其生產方法和應用。

背景技術

人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是一種低度聚合糖，是母乳中第三大固體成分。因缺少相關的酶，它不會在人的腸道內被消化，但可被腸道內的微生物特別是有益微生物降解，從而起到營養腸道上皮細胞作用，同時可降低結腸pH值，抑制有害細菌的增殖。并且人乳寡糖具有與腸黏膜細胞表面的多糖類似的抗原表位，從而可競爭性的抑制致病菌的結合并抵御病原微生物的侵襲。2-巖藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-FL)，是人乳中最豐富的寡糖之一。在嬰兒體內，2'-FL不會被消化，可到達結腸后表現為可溶性益生元。研究表明，含有2'-FL強化配方奶粉具有類似于母乳喂養的卡路里密度，類似于母乳喂養的對照組，喂食2'-FL配方奶粉的嬰兒表現出較低的血漿和離體炎癥細胞因子表征。基于上述研究，美國食品藥品監督管理局(FDA)于2016年、歐盟食品安全局(EFSA)于2017年批準2'-FL作為新食品成分使用，且雅培公司和雀巢公司新進推出了添加2'-FL的嬰兒奶粉。

目前有兩種方法可大量生產2'-FL，(1)化學法；(2)微生物體內合成法。化學法工藝繁瑣，副產物多，且環保壓力大，因此微生物體內合成法是目前公認的更好的選擇。通過微生物發酵方法得到2'-FL，主要考慮如下三個方面進行優化：①作為合成2'-FL的受體乳糖的含量；②作為合成2'-FL的供體鳥苷二磷酸巖藻糖(GDP-Fuc)的含量；③2'-FL合成酶(FucT)的活性。下面分別從上述三個方面分析如何優化從而高效合成2'-FL。

受體乳糖的攝取：乳糖價格低廉，Abramson等，證明大腸桿菌K12中的乳糖通透酶(LacY)能夠協助乳糖從培養基進入到細胞質中，但在大腸桿菌體內存在β-半乳糖苷酶(LacZ)可降解乳糖，因此為維持大腸桿菌胞內高濃度的乳糖，需要敲除LacZ基因(Microb.Cell Fact.2013，12,40.；Microb.Cell Fact.2012，11,48.；Glycobiology.2002,12,235.)。乳糖乙酰化酶(LacA)使體內高濃度的乳糖轉化為乙酰乳糖，從而抑制大腸桿菌的生長，因此為了更好的保持體內高濃度的乳糖，證明敲除LacA基因有利于高濃度乳糖的維持(Bioessays.2009,31,769.)。

供體GDP-Fuc的生成：GDP-Fuc是大腸桿菌的天然中間體莢膜異多糖酸生物合成的中間體，但體內的GDP-Fuc含量較低不足以滿足合成2'-FL的供體需求。GDP-Fuc可以通過兩條途徑合成：(1)一個是天然存在于大腸桿菌中的從頭合成途徑(de novo pathway)，該方法利用五種重組酶(Man A，ManB，ManC，Gmd，WcaG/Fcl)從果糖-6-磷酸合成GDP-Fuc，從而進一步合成2'-FL(Microb.Cell Fact.2013,12,40.；Biotechnol.Bioeng.2016,113,2443.)。(2)另外一種補救途徑(salvage pathway)天然存在于一些擬桿菌菌株和哺乳動物細胞中，在此途徑中，通過重組表達一種來自脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)的雙功能酶，L-巖藻糖1-激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶(FKP)，可以利用L-巖藻糖合成GDP-巖藻糖(GDP-Fuc)，從而通過2'-FL合成酶進一步合成2'-FL(Biotechnol Bioeng.2016,113,2443)。Seo等證明敲除大腸桿菌BL21(DE3)菌種巖藻糖異構酶(FucI)和核酮糖激酶(FucK)等基因更有利于體內GDP-Fuc的積累和2'-FL的合成(Biotechnol Bioeng,2016,113,2443).