[發(fā)明專利]一種基因工程菌制備2-巖藻糖基乳糖的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811516891.0
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109554385B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳志剛;周曉雷;鄒衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 石家莊葛蘭德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 陸金星

1.一種2-巖藻糖基乳糖基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）敲除原始菌株中與2-巖藻糖基乳糖合成代謝途徑相關(guān)的基因，獲得基因敲除菌株，所述敲除的基因為：LacA、FucI和FucK；

（2）增強步驟（1）中所述基因敲除菌株中與2-巖藻糖基乳糖合成代謝途徑相關(guān)的基因，所述增強的基因為L-巖藻糖1-激酶/ GDP-巖藻糖焦磷酸化酶FKP和2-巖藻糖基乳糖合成酶FucT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述增強步驟（1）中所述基因敲除菌株中與2-巖藻糖基乳糖合成代謝途徑相關(guān)的基因的方法包括如下步驟：

A. 構(gòu)建過表達(dá)FKP和2-巖藻糖基乳糖合成酶基因的重組載體；

B. 將步驟A中所述重組載體導(dǎo)入基因敲除菌株中，獲得2-巖藻糖基乳糖生產(chǎn)菌株。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的構(gòu)建方法，其特征在于2-巖藻糖基乳糖合成酶FucT選自幽門螺旋桿菌FucT、鼬鼠螺桿菌FucT或嗜熱聚球藻FucT； FKP為脆弱擬桿菌FKP。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的構(gòu)建方法，其特征在于2-巖藻糖基乳糖合成酶為1個或多個串聯(lián)重復(fù)序列，所述串聯(lián)重復(fù)序列之間通過連接多肽連接，所述連接多肽為柔性多肽，序列為GGGGS或GGGGSGGGGS。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述2-巖藻糖基乳糖合成酶為1個或多個串聯(lián)重復(fù)序列，所述串聯(lián)重復(fù)序列之間通過連接多肽連接，所述連接多肽為柔性多肽，序列為GGGGS或GGGGSGGGGS。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述2-巖藻糖基乳糖合成酶為2個串聯(lián)重復(fù)，所述串聯(lián)重復(fù)序列之間通過柔性多肽連接，柔性多肽序列為GGGGS或GGGGSGGGGS。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于其中的柔性多肽序列為GGGGSGGGGS。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述2-巖藻糖基乳糖合成酶為2個串聯(lián)重復(fù)，所述串聯(lián)重復(fù)序列之間通過柔性多肽連接，柔性多肽序列為GGGGS或GGGGSGGGGS。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于其中的柔性多肽序列為GGGGSGGGGS。

10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述2-巖藻糖基乳糖合成酶FucT為幽門螺旋桿菌FucT。

11.權(quán)利要求1-10任一項構(gòu)建方法構(gòu)建獲得的基因工程菌。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的基因工程菌，其特征在于所述原始菌株為大腸桿菌。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的基因工程菌，其特征在于所述原始菌株為大腸桿菌JM109（DE3）。

14.權(quán)利要求11-13任一項所述的基因工程菌用于生產(chǎn)2-巖藻糖基乳糖的應(yīng)用。

15.一種2-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)方法，其特征在于通過發(fā)酵權(quán)利要求11-13任一項所述的基因工程菌生產(chǎn)。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的生產(chǎn)方法，其特征在于還包括在發(fā)酵之后利用β-半乳糖苷酶（LacZ）重組菌降解多余的乳糖。

17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的生產(chǎn)方法，其特征在于該生產(chǎn)方法中發(fā)酵使用的種子培養(yǎng)基組成為KH₂PO₄ 7.8 g/L, 檸檬酸1 g/L, (NH₄)₂SO₄, 2.33 g/L, Trace metalsolution 1 ml/L, 甘油 22 g/L, MgSO₄ 1 g/L, CaCl₂ 40 mg/L, 卡那霉素50 mg/L；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為KH₂PO₄ 2.2 g/L, 檸檬酸1 g/L, (NH₄)₂SO₄, 4.5 g/L, Trace metalsolution 1 ml/L, 維生素B 210 mg/L, 甘油 22 g/L, MgSO₄ 1 g/L, CaCl₂ 40 mg/L, 消泡劑 204 75 μL/L, 卡那霉素50 mg/L。