[發(fā)明專利]一種牛支原體的iiPCR檢測方法及檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811514557.1
• 申請日: 2018-12-12
• 公開（公告）號: CN109536625B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 儲岳峰;翟肖輝;顏新敏;郝華芳;陳勝利;劉永生
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12R1/35
• 代理公司: 深圳峰誠志合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44525
• 代理人: 陳婷

本發(fā)明公開了一種牛支原體的iiPCR檢測方法及檢測試劑盒。本發(fā)明通過以牛支原體的P80基因序列為模板，從P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以該R1序列為目標(biāo)設(shè)計(jì)探針M.b?specific?Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。相應(yīng)的，本發(fā)明的檢測試劑盒，其成分除了商品化的Premix Ex Taq外，主要包括特別設(shè)計(jì)的牛支原體特異性的引物、探針及配套試劑：M.b?specific?Forward，M.b?specific?Reverse，M.b?specific?Probe，Nuclease?free water，陽性對照模板。本發(fā)明除了用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測牛支原體核酸外，特別適用于無實(shí)驗(yàn)室條件下(如基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場等)的現(xiàn)場檢測，具有高特異性和靈敏性，是一種快速、準(zhǔn)確的牛支原體核酸檢測試劑盒，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種牛支原體的iiPCR檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)

牛支原體(mycoplasma bovis，M.bovis)是感染牛的一種重要的致病性病原體，能夠引起犢牛肺炎、乳房炎、耳炎、生殖道炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、流產(chǎn)與不孕等多種疾病，這些疾病統(tǒng)稱為牛支原體相關(guān)疾病(MbAD)。近年來，MbAD已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，且牛支原體還可以與其他病原造成繼發(fā)感染或混合感染，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，對牛支原體的檢測方法主要有病原分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)診斷方法。牛支原體的分離培養(yǎng)在試驗(yàn)操作方面要求嚴(yán)格，分離鑒定難度大，分離周期長，判斷結(jié)果時(shí)只靠肉眼觀察，沒有足夠的可靠依據(jù)，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；血清學(xué)檢測既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且靈敏度不高；分子生物學(xué)方法方便快捷、靈敏度高，主要有常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，這些檢測方法雖然避免了上述兩類方法的缺陷，但是需要在有精密儀器的實(shí)驗(yàn)室中操作，限制了在現(xiàn)場快速檢測診斷上的推廣應(yīng)用。iiPCR(恒溫隔絕式PCR)方法憑借特異性引物和探針，有效地增加了檢測的特異性和敏感性，同時(shí)大大提高了檢測速度和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率，且該方法實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的全封閉自動(dòng)操作，避免了DNA的污染，具有廣泛的現(xiàn)場實(shí)用性，可確保快速、準(zhǔn)確地檢測病原體，在病原體的快速定性檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種牛支原體的iiPCR檢測方法及檢測試劑盒，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)敏感性不高，檢測條件要求過高，準(zhǔn)確率低，或反應(yīng)體系不穩(wěn)定、不易保藏等問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種牛支原體的iiPCR檢測方法，通過iiPCR法檢測牛支原體核酸，該方法以牛支原體的P80基因序列為模板，從P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以該R1序列為目標(biāo)設(shè)計(jì)探針M.b-specific-Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。

優(yōu)選地，所述R1序列為：TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC。

優(yōu)選地，所述探針M.b-specific-Probe為：5’-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3’；其中，F(xiàn)為熒光報(bào)告基團(tuán)，Q為熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選地，所述M.b序列的克隆引物為：

M.b-specific-Forward：5’-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3’；

M.b-specific-Reverse：5’-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3’。

優(yōu)選地，所述iiPCR法包括以下步驟：

(1)以牛支原體的P80基因?yàn)槟０宀⒃O(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到M.b序列產(chǎn)物；

(2)切膠回收純化后連接到pMD18-T載體上，然后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入到DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆子；