[發明專利]一種牛支原體的iiPCR檢測方法及檢測試劑盒有效
| 申請號： | 201811514557.1 | 申請日： | 2018-12-12 |
| 公開（公告）號： | CN109536625B | 公開（公告）日： | 2023-01-03 |
| 發明（設計）人： | 儲岳峰;翟肖輝;顏新敏;郝華芳;陳勝利;劉永生 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院蘭州獸醫研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12R1/35 |
| 代理公司： | 深圳峰誠志合知識產權代理有限公司 44525 | 代理人： | 陳婷 |
| 地址： | 730046 甘肅*** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 種牛 支原體 iipcr 檢測 方法 試劑盒 | ||
1.一種牛支原體的iiPCR檢測方法，所述檢測方法用于非疾病診斷目的應用，通過iiPCR法檢測牛支原體，其特征在于，該方法以牛支原體的P80基因序列為模板，從P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，
所述序列通過
M.b-specific-Forward：5’-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3’和M.b-specific-Reverse：5’-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3’序列擴增得到，以該R1序列為目標設計探針M.b-specific-Probe；
其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示；
所述探針M.b-specific-Probe為：
5’-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3’；其中，F為熒光報告基團，Q為熒光淬滅基團；
所述M.b序列的克隆引物為：M.b-specific-Forward：5’-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3’；M.b-specific-Reverse：5’-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3’；
在步驟(3)中，所述iiPCR反應體系具體為：反應體系為50μL，其中Premix Ex Taq25μL，上、下游引物10μM各0.8μL，探針10μM 0.4μL，ddH2O 18μL，DNA模板5μL。
2.如權利要求1所述的牛支原體的iiPCR檢測方法，其特征在于，所述iiPCR法包括以下步驟：
(1)以牛支原體的P80基因為模板并設計引物，PCR擴增得到M.b序列產物；
(2)切膠回收純化后連接到pMD18-T載體上，然后將連接產物導入到DH-5a感受態細胞，篩選出陽性克隆子；
(3)建立iiPCR反應體系，該體系中包括探針M.b-specific-Probe，往該iiPCR反應體系分別加入牛支原體和其它基因組DNA為模板，檢測陽性結果。
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