[發(fā)明專利]一種提高牛大力多糖產(chǎn)量的細(xì)胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811513386.0
• 申請日: 2018-12-11
• 公開（公告）號: CN109315294A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁偉藝;鐘靜海
• 申請（專利權(quán)）人: 梁偉藝
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

本發(fā)明公開了一種提高牛大力多糖產(chǎn)量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括：步驟1)選取雞血藤即將成熟種子，對其進(jìn)行消毒，處理，將其放置于萌發(fā)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，即將成熟種子為開花后90～130天的雞血藤植株的種子，消毒包括：采用次氯酸鈣的溶液清洗，再于溫度70～80℃下處理20～30秒；步驟2)取嫩葉作為外植體，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得愈傷組織；步驟3)將愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)至少二次，至其生長成為細(xì)胞團(tuán)；步驟4)將細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行懸浮啟動培養(yǎng)，獲得懸浮細(xì)胞系；步驟5)將懸浮細(xì)胞系進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得雞血藤懸浮細(xì)胞系。步驟6)將雞血藤懸浮細(xì)胞系收集細(xì)胞，純凈水提取3次，合并三次提取液，離心，將沉淀干燥后得到牛大力多糖。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及中藥材栽培技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高牛大力多糖產(chǎn)量的細(xì)胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

雞血藤，中藥名。為豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖。秋、冬二季采收，除去枝葉，切片，曬干。分布于廣東、廣西、云南等地。具有活血補(bǔ)血，調(diào)經(jīng)止痛，舒筋活絡(luò)之功效。用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)，經(jīng)閉，風(fēng)濕痹痛，麻木癱瘓，血虛萎黃。隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，雞血藤的根部，牛大力富含多糖等多種物質(zhì)，具有明顯的抗腫瘤作用，在醫(yī)學(xué)上的需求量越來越大。野生雞血藤植株的產(chǎn)量已經(jīng)不能滿足市場需求。為滿足對該中藥材的需求，近年來，逐漸采用人工栽培及組織培養(yǎng)的方式對雞血藤進(jìn)行培養(yǎng)。組織培養(yǎng)由于具有培養(yǎng)時(shí)間短、不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)，逐漸快速發(fā)展起來。然而，在組織培養(yǎng)中，由于培養(yǎng)時(shí)間較短，因此雞血藤懸浮細(xì)胞中多糖等物質(zhì)的含量較野生型少。如何在較短的時(shí)間內(nèi)使得培養(yǎng)的雞血藤懸浮細(xì)胞中含有較多量的多糖，是目前正在積極探究的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種提高牛大力多糖產(chǎn)量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括：

一種提高牛大力多糖產(chǎn)量的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括：

步驟1)首先選取雞血藤即將成熟種子，然后對即將成熟種子進(jìn)行消毒，再于溫度0～2℃下處理24～48h，最后將其放置于萌發(fā)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)至其長出1～10mm長度的嫩葉，所述即將成熟種子為開花后90～130天的雞血藤植株的種子，所述消毒包括：首先采用含有質(zhì)量體積濃度1～5g/mL次氯酸鈣的溶液清洗所述即將成熟種子若干次，然后將清洗后的種子于溫度70～80℃下處理20～30秒，所述萌發(fā)液體培養(yǎng)基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA 0.1～0.3mg/L，其初始pH值為5.8；

步驟2)選取經(jīng)過萌發(fā)培養(yǎng)長出的嫩葉作為外植體，將所述外植體置于誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得愈傷組織，所述誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基包含：MS，6-BA 0.2～0.5mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂膠5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2～10％的銀杏葉汁液和瓊脂8g/L；

步驟3)將所述愈傷組織在繼代固體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)至少二次，至其生長成為淡綠色的顆粒狀的疏松的細(xì)胞團(tuán)，所述繼代固體培養(yǎng)基包含：MS，6-BA 0.5～1mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂膠15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5～15％的銀杏葉汁液和瓊脂8g/L；

步驟4)將所述細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至啟動液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮啟動培養(yǎng)，獲得懸浮細(xì)胞系，所述啟動液體培養(yǎng)基包含：1/4～1/2MS、6-BA 0.2～0.6mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂膠10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2～10％的銀杏葉汁液；

步驟5)將所述懸浮細(xì)胞系接種至增殖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得雞血藤懸浮細(xì)胞系，所述增殖液體培養(yǎng)基包含：1/2MS、6-BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂膠10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2～10％的銀杏葉汁液。