[發明專利]一種提高牛大力多糖產量的細胞培養方法

在審

• 申請號: 201811513386.0
• 申請日: 2018-12-11
• 公開（公告）號: CN109315294A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 梁偉藝;鐘靜海
• 申請（專利權）人: 梁偉藝
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 靳浩

1.一種提高牛大力多糖產量的細胞培養方法，其特征在于，包括：

步驟1)首先選取雞血藤即將成熟種子，然后對即將成熟種子進行消毒，再于溫度0～2℃下處理24～48h，最后將其放置于萌發液體培養基中進行萌發培養至其長出1～10mm長度的嫩葉，所述即將成熟種子為開花后90～130天的雞血藤植株的種子，所述消毒包括：首先采用含有質量體積濃度1～5g/mL次氯酸鈣的溶液清洗所述即將成熟種子若干次，然后將清洗后的種子于溫度70～80℃下處理20～30秒，所述萌發液體培養基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6-BA 0.1～0.3mg/L，其初始pH值為5.8；

步驟2)選取經過萌發培養長出的嫩葉作為外植體，將所述外植體置于誘導固體培養基上進行誘導培養，獲得愈傷組織，所述誘導固體培養基包含：MS，6-BA 0.2～0.5mg/L，NAA0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂膠5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、質量分數2～10％的銀杏葉汁液和瓊脂8g/L；

步驟3)將所述愈傷組織在繼代固體培養基中進行繼代培養至少二次，至其生長成為淡綠色的顆粒狀的疏松的細胞團，所述繼代固體培養基包含：MS，6-BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂膠15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、質量分數5～15％的銀杏葉汁液和瓊脂8g/L；

步驟4)將所述細胞團轉移至啟動液體培養基中進行懸浮啟動培養，獲得懸浮細胞系，所述啟動液體培養基包含：1/4～1/2MS、6-BA 0.2～0.6mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂膠10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和質量分數2～10％的銀杏葉汁液；

步驟5)將所述懸浮細胞系接種至增殖液體培養基中進行增殖培養，獲得雞血藤懸浮細胞系，所述增殖液體培養基包含：1/2MS、6-BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂膠10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和質量分數2～10％的銀杏葉汁液；

步驟6)將所述雞血藤懸浮細胞系以轉速2000～3000rpm、溫度0～4℃下離心3～5分鐘收集細胞，然后于恒溫水浴90～100℃下，分別用純凈水提取3次，第一次提取用的純凈水用量與細胞的干重的比例為10:1，第一次提取時間為40min，第二次提取用的純凈水用流量與細胞的干重的比例為5:1，第二次提取時間為10min，第三次提取用的純凈水于細胞的干重的比例為2:1，第三次提取時間為5min，合并三次提取液，之后向其中加入體積百分比75％的乙醇，以轉速6000～8000rpm、溫度0～4℃下離心3～5min后棄去廢液，將沉淀干燥后得到牛大力多糖。

2.根據權利要求1所述的提高牛大力多糖產量的細胞培養方法，其特征在于，步驟1)中，所述即將成熟種子為開花后110天的雞血藤植株的種子。

3.根據權利要求1所述的提高牛大力多糖產量的細胞培養方法，其特征在于，步驟1)中，所述消毒包括：首先采用含有質量體積濃度3g/mL次氯酸鈣的溶液清洗所述即將成熟種子若干次，然后將清洗后的種子于溫度75℃下處理25秒。

4.根據權利要求1所述的提高牛大力多糖產量的細胞培養方法，其特征在于，步驟1)中，所述萌發液體培養基包含：1/43MS、蔗糖11g/L和6-BA 0.2mg/L。

5.根據權利要求1所述的生產牛大力多糖的方法，其特征在于，步驟4)中，所述懸浮啟動培養的接種量為3～5g/L繼代培養產物。

6.根據權利要求1所述的生產牛大力多糖的方法，其特征在于，步驟5)中，所述增殖培養的接種量比例為：取占所述增殖液體培養基10％～20％的懸浮啟動培養后的培養物。

7.根據權利要求1所述的生產牛大力多糖的方法，其特征在于，所述銀杏葉汁液的獲取方法為：取銀杏葉片按照質量比10:1加入水，之后粉碎，并以200目過濾篩過濾，得到濾液即為銀杏葉汁液。