[發明專利]基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組、試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 201811510511.2
• 申請日: 2018-12-11
• 公開（公告）號: CN109536611A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 李同恩;孟慶艷;陳興京;楊俊紅;張振宇;朱兵;崔斌;劉宇飛;賀紅芳;劉明明;林鑫
• 申請（專利權）人: 北京中源維康基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

本發明公開了一種基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組、試劑盒及使用方法，本發明提供4個基因的29個用于評估人類罹患肺癌風險的特異性和敏感性的基因突變位點，利用MassARRAY核酸質譜技術對這些位點進行基因分析檢測。與普通核酸質譜檢測產品不同的是，本試劑盒將野生基因型一致的位點置于一個反應孔中，通過人為減少該孔野生型ddNTPs加入量的方法降低其信號值，從而提高試劑盒的靈敏度。應用本方法檢測福爾馬林固定、石蠟包埋組織(FFPE)樣本，其檢測限可低至1％。此方法相較qPCR及二代測序平臺，具有設計靈活、準確性高、成本低、操作簡便等優勢。

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，尤其是涉及一種基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組、試劑盒及使用方法，利用多重PCR技術、單堿基延伸技術和核酸質譜技術，對肺癌相關的4個基因29個位點進行基因突變檢測。

背景技術

腫瘤是多基因經歷多步驟變化導致細胞周期紊亂，使細胞失控性生長而形成的新生長物。肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small celllung cancer,NSCLC)占肺癌的85％左右，NSCLC中又以腺癌最常見。在腫瘤學、遺傳學等多學科研究中發現，大多數NSCLC患者存在表皮生長因子受體(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)等原癌基因和抑癌基因的突變，它們在腫瘤的形成及其介導瘤細胞的生物行為中發揮著重要的作用，因此這些基因成為抗腫瘤靶向治療藥物的重要靶點之一。

癌癥臨床治療的有效率目前仍然偏低，這與癌癥復雜的發生機理和患者個體化差異密切相關。隨著人類基因組學、藥物基因組學及癌癥分子生物學研究的不斷深入和發展，研究表明人體中某些基因與癌癥的靶向或化療藥物的療效或毒性是密切相關的，對這些特定基因進行檢測，簡單的說就是取被檢測者的組織細胞、血液或胸腔積液，經提取和純化其基因信息后，通過特定設備對被檢測者細胞中的特定基因作檢測，分析基因的狀態為癌癥患者提供治療方案參考更具科學性，并節省患者的時間和金錢。

核酸質譜檢測技術聯合PCR技術、單堿基延伸技術，通過PCR擴增技術放大檢測樣本模板量；利用具有“微測序”之稱的單堿基延伸技術特異性延伸一個堿基，準確性極高；尤其是質譜檢測目標為物質的分子量，無需熒光探針標記，識別單堿基之間的差異時分辨率高達9Da，使得該技術在基因檢測領域具有非常旺盛的生命力。該平臺用于核酸檢測時靈敏度高達1％，且樣本需求量低。該技術自2002年榮獲諾貝爾獎以來，受到各界廣泛關注，在醫學、農業等各大領域已有眾多應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組、試劑盒及使用方法，利用MassARRAY核酸質譜技術對這些位點進行基因分析檢測。與普通核酸質譜檢測產品不同的是，本試劑盒將野生基因型一致的位點置于一個反應孔中，通過人為減少該孔野生型ddNTPs加入量的方法降低其信號值，從而提高試劑盒的靈敏度。應用本方法檢測福爾馬林固定、石蠟包埋組織(FFPE)樣本，其檢測限可低至1％。此方法相較qPCR及二代測序平臺，具有設計靈活、準確性高、成本低、操作簡便等優勢。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組，引物組包括PCR擴增引物和單堿基延伸引物，PCR擴增引物序列為SEQ ID No.1-18，單堿基延伸引物序列為：SEQ ID No.19-45。

所述單堿基延伸引物分為8組：

一種檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒，包括：

1)用于PCR的反應試劑，包括SEQ ID No.1-18所述PCR擴增引物，耐高溫的DNA聚合酶，dNTPs，MgCl₂，PCR反應緩沖液；

3)用于PCR產物純化的試劑，包括蝦堿性磷酸酶，蝦堿性磷酸酶緩沖液；