[發明專利]基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組、試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 201811510511.2
• 申請日: 2018-12-11
• 公開（公告）號: CN109536611A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 李同恩;孟慶艷;陳興京;楊俊紅;張振宇;朱兵;崔斌;劉宇飛;賀紅芳;劉明明;林鑫
• 申請（專利權）人: 北京中源維康基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

1.一種基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組，其特征在于，引物組包括PCR擴增引物和單堿基延伸引物，PCR擴增引物序列為SEQ ID No.1-18，單堿基延伸引物序列為：SEQ ID No.19-45。

2.根據權利要求1所述基于核酸質譜技術檢測人類肺癌相關基因突變的引物組，其特征在于，所述單堿基延伸引物分為8組：

3.一種檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒，其特征在于，包括：

1)用于PCR的反應試劑，包括權利要求1所述PCR擴增引物，耐高溫的DNA聚合酶，dNTPs，MgCl₂，PCR反應緩沖液；

2)用于PCR產物純化的試劑，包括蝦堿性磷酸酶，蝦堿性磷酸酶緩沖液；

3)用于單堿基延伸的試劑，包括權利要求1或2所述的單堿基延伸引物，耐高溫的單堿基延伸酶，ddNTPs，延伸反應緩沖液。

4.根據權利要求3所述檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒，其特征在于，試劑盒還包括：陰性質控品，陽性質控品，純化用樹脂，點樣及質譜檢測用的靶板。

5.根據權利要求3所述檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒，其特征在于，用來評估人類罹患肺癌風險的特異性和敏感性的基因突變位點為：EGFR_pL858R、EGFR_pE709AGV、EGFR_pE709K、EGFR_pT790M、EGFR_pG719AD、EGFR_pS768I、EGFR_pG719SC、EGFR_pL861QR、EGFR_pE746_A750delⅠ、EGFR_pE746_A750delⅡ、EGFR_pV769_D770insASV、KRAS_pG13D、KRAS_pG12ADV、KRAS_pG12SRC、KRAS_pG13C、BRAF_pV600E、PIK3CA_pH1047RL、PIK3CA_pE542K、PIK3CA_pE545K。

6.如權利要求3-4任一項所述檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟:

1)多重PCR反應：在一個反應體系內，以待測樣本DNA為模板，使用特異性的針對包含所檢測基因突變位點的PCR擴增引物，通過多重PCR同時擴增含有不同待檢基因位點的序列，得到含擴增目標區域的PCR產物；

2)利用蝦堿性磷酸化酶消化步驟1)反應體系中剩余的dNTPs；

3)利用單堿基延伸引物對步驟2)消化后的產物進行單堿基延伸反應，獲得延伸產物；

5)利用MassARRAY平臺進行樹脂純化、芯片點樣、質譜檢測，結果使用TYPER4.0軟件分析并輸出結果，通過變異堿基處是否出峰來判斷突變類型。

7.根據權利要求6所述檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟1)的PCR反應條件為：95℃、2min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，45個循環；72℃、5min；4℃保持。

8.根據權利要求6所述檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟2)的消化條件為：37℃、40min；85℃、5min；4℃保持。

9.根據權利要求6所述檢測人類肺癌相關基因突變的試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟3)的延伸反應條件為：95℃、30s；95℃、5s，(52℃、5s，80℃、5min)5個循環，40個循環；72℃、3min；4℃保持。