[發明專利]一種環狀RNA hsa-circ-0044513及其特異性擴增引物和應用

在審

• 申請號: 201811508551.3
• 申請日: 2018-12-11
• 公開（公告）號: CN109402126A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 王立斌;張旭
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學總醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京弘權知識產權代理事務所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

1.一種環狀RNA，其特征在于，所述環狀RNA在circ-RNA數據庫中的全稱為hsa-circ-0044513，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.權利要求1所述環狀RNA用作篩查乳腺癌的分子標志物的用途。

3.用于擴增權利要求1所述環狀RNA的特異性擴增引物，其特征在于，所述特異性擴增引物包括上游引物和下游引物，其中，

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.一種擴增權利要求1所述環狀RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟1，合成第一鏈cDNA：混合原料，所述原料包括權利要求1所述環狀RNA、隨機引物、ddH₂O、dNTP混合液、反轉錄緩沖液、RNA酶抑制劑、反轉錄酶，按照第一程序控溫反應；

步驟2，對步驟1制得的第一鏈cDNA進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應擴增：配制擴增體系，所述擴增體系包括步驟1制備的cDNA、如權利要求3所示的上游引物、如權利要求3所示的下游引物、ddH₂O、qPCR擴增熒光染料Mix，按照第二程序控溫反應。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟1中，

所述原料的按照如下配比混合：1μl權利要求1所述環狀RNA，1μl隨機引物，10μl ddH₂O，2μl dNTP混合液，4μl反轉錄緩沖液，1μl RNA酶抑制劑，1μl反轉錄酶，其中，所述dNTP混合液包括dATP，dGTP，dCTP和dTTP；

所述第一程序為：25℃條件下反應5min，42℃條件下反應60min，最后在70℃條件下反應5min。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2中，

所述擴增體系按照如下配比配制：2μl步驟1制備的cDNA，0.5μl如權利要求3所述的上游引物，0.5μl如權利要求3所述的下游引物，7μl ddH₂O，10μl qPCR擴增熒光染料Mix；；

所述第二程序為：95℃預變性10s，然后以95℃反應15s、60℃反應30s、72℃反應40s進行40個循環，以95℃反應5s、65℃反應1min、37℃反應1min，最后終止反應。

7.權利要求3所述的特異性擴增引物在制備用于乳腺癌篩查的試劑盒中的應用。

8.一種用于乳腺癌篩查的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求3所述的特異性擴增引物。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反轉錄酶、緩沖液、ddH₂O、DNA聚合酶、熒光染料和dNTP混合液中的至少一種。