[發明專利]一種測定C反應蛋白的化學發光免疫方法

有效

• 申請號: 201811501173.6
• 申請日: 2018-12-10
• 公開（公告）號: CN109298187B
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 李萍;宗晨;張多多;楊華
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 43210 長沙新裕知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙超

本發明公開了一種測定C反應蛋白的化學發光免疫方法。本發明方法的流程示意圖如摘要附圖所示，該方法發光強度和發光效率高，對C反應蛋白的檢測靈敏度高；通過將其他抗原、CRP以及CRP和其他抗原的混合物在CRP免疫傳感陣列上進行溫育，評價該免疫傳感陣列和其他非特異性吸附分析物之間的交叉反應性，CRP免疫傳感陣列只在目標CRP存在時才會產生強的信號響應，表明本法特異性良好，可忽略交叉反應的影響；將該法用于測定五組人血清樣品中的CRP濃度，將測定結果與商業化的電致化學發光檢測法進行比較，相對誤差≤4.94％，表明本法結果準確可靠。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種測定C反應蛋白的化學發光免疫方法。

背景技術

國內外流行病學調查表明，腦血管疾病是一種嚴重威脅人類健康和壽命的常見疾病。在我國，每年因腦血管病死亡近100萬人，在幸存者中約3/4的人留下偏癱等后遺癥狀，部分病人喪失勞動能力和生活能力。鑒于腦血管疾病具有“發病率高、致殘率高、死亡率高、復發率高、并發癥多”的特點，應對之早診斷、早治療。伴隨腦血管疾病過程產生的生物標記物，能夠直接或者間接反映腦血管系統的疾病狀況，例如C反應蛋白(CRP)、人血管性血友病因子(VWF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、肌鈣蛋白T(cTnT)等，對這些標志物的含量進行準確可靠的檢測，是腦血管疾病的診斷、危險分層及評估預后的關鍵。發展新型的簡單、靈敏、可靠的腦血管疾病標志物檢測方法，對我國腦血管疾病防治事業至關重要、意義深遠。

近年來，化學發光成為檢測生物標志物的有效分析工具。與熒光光譜、磷光光譜和紫外-可見光譜等其他光學技術相比，基于化學發光的檢測無需外部光源，因此減少了光散射并消除了不必要的信號干擾。此外，它具有儀器簡單、分析快速、檢出限低、線性范圍寬的優點。

但是，基于化學發光的檢測通常受到反應產率和量子產率的經典光化學性質的限制，需要增加量子產率和加速化學發光反應，才能提高基于化學發光的生物測定的靈敏度和效率。

發明內容

本發明目的在于提供一種量子產率增加、化學發光反應加速的化學發光免疫方法測定C反應蛋白(CRP)，提高化學發光法測定CRP的靈敏度和效率。

本發明上述目的通過如下技術方案實現：

一種測定C反應蛋白CRP的化學發光免疫方法，包括如下步驟：

步驟S1，CRP免疫傳感器芯片的制備：

在醛基片表面粘貼一層疏水、無光活性膜，構建出若干個傳感池；取10μg/mL CRP的包被抗體Ab110μL滴加到傳感池中，4℃下溫育過夜，用沖洗緩沖液沖洗并干燥，實現將Ab1固定在醛基片表面，構建出具有若干個檢測位點的CRP免疫傳感器芯片；

步驟S2，探針A、B的合成：

探針A的合成：25μL 10μM DNA-A、25μL 10μM DNA-hemin、25μL 10μMbiotin-DNA緩慢加入1mL銀納米粒子溶液中，常溫下緩慢攪拌反應18小時，其后，加入25μL 10μM SH-A15攪拌2小時來封閉還有活性位點的銀納米粒子，122μL0.01M PBS(pH 7.4)加入溶液反應6h，然后21μL 2M NaCl加入溶液，3h后重復將21μL 2M NaCl加入溶液；12h后，26μL 2M NaCl加入溶液，3h后重復將26μL 2M NaCl加入溶液；48小時后，溶液在14℃、15000rpm下離心15min，將沉淀分散在1mL 0.2M PBS⁺；

探針B的合成：25μL 10μM DNA-B、25μL 10μM DNA-hemin緩慢加入1mL銀納米粒子溶液中，常溫下緩慢攪拌反應18小時，其余步驟同探針A的合成；

步驟S3，標準曲線的建立：