[發明專利]一種隱孢子蟲蛋白激酶的純化方法

有效

• 申請號: 201811497728.4
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109735513B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發明（設計）人: 馮耀宇;蘇嘉緣;張強;李娜;郭亞瓊
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;華南農業大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

本發明公開了一種隱孢子蟲蛋白激酶的純化方法，先通過構建隱孢子蟲蛋白激酶的體外重組表達載體，再進行質粒轉導、IPTG低溫誘導表達，成功表達后的菌體裂解后，經割膠回收純化蛋白；本發明純化方法通過低溫誘導以及改善IPTG濃度的方式，提高了表達蛋白的可溶性，同時通過割膠回收的方法解決了隱孢子蟲蛋白激酶在體外表達中易出現的自切降解包涵體表達等問題，能夠得到高純度條帶單一且具備酶學活性的重組蛋白，并且能夠提高對難以表達、分子量較大蛋白的純化效果。所純化得到的蛋白能夠進一步用于功能性分析研究，為解決隱孢子蟲蛋白功能領域的諸多問題奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種隱孢子蟲蛋白激酶的體外重組蛋白的純化方法。

背景技術

隱孢子蟲（ Cryptosporidium）是分布廣泛、危害嚴重的腹瀉病病原。隱孢子蟲為頂復門的寄生原蟲，包括70多個已知的蟲種和基因型。以感染幾乎所有的脊椎動物，導致以腹瀉，尤其是幼齡動物持續性水樣腹瀉為主要癥狀的疾病。隱孢子蟲對幼齡牛、羊和豬感染率很高（30%），對一歲內家畜累計感染率為100%，同時是多國奶牛腹瀉的主要病原。因此，該病對養殖業造成嚴重危害。

此外，隱孢子蟲還是重要的人獸共患病原，是發展中國家兒童腹瀉的二號病原。全球每年因腹瀉致死的兒童病例中，10%由該病原引起。由于引起大規模疾病暴發，隱孢子蟲是多數發達國家的法定傳染病病原，也是多國（包括我國）水質標準中僅有的兩個病原之一。由于對隱孢子蟲的入侵機制了解有限，導致缺乏有效的隱孢子蟲病藥物。在治療隱孢子蟲病的潛在藥物中，只有硝唑尼特（Nitazoxanide）是美國FDA批準的唯一藥物，但該藥物對免疫低下人群和動物無效。

蛋白激酶在頂復門原蟲入侵和發育中起重要作用，但它們在隱孢子蟲入侵中的作用并未得到系統研究。頂復門原蟲具有保守的入侵機制。這期間細胞器蛋白的分泌、活化以及蟲體對宿主細胞膜和免疫通路的修飾，都離不開蛋白激酶對蛋白的活化作用。因沒有純化得到隱孢子蟲的蛋白，這些蛋白的功能還不能準確驗證。

例如，鈣依賴蛋白激酶CDPK（Calcium-depending?protein?kinase）以及胰島素降解酶（insulin-degrading?enzyme?or?IDE;?insulin?protease;?insulysin;insulinase）被列為潛在的藥物靶標。研究表明蟲體形態的改變、細胞骨架的重排及其對宿主細胞的識別、附著、入侵和一些分泌蛋白的排放及蟲體從宿主細胞的逃逸等過程，均與鈣離子的作用密切相關。加工和激活這些蛋白并完成與宿主細胞的受體結合需要多種蛋白酶的協同作用，特別是金屬蛋白酶的參與。

由于隱孢子蟲蛋白激酶在體外表達過程中常出現片段化表達或表達過程中出現自切降解等情況，所以通過常規純化方法難得到較純的蛋白，且活性無法得到保證，影響后續蛋白功能及酶學的研究，也阻礙了隱孢子蟲入侵機制的系統性研究。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有隱孢子蟲蛋白激酶體外表達及純化過程中的缺陷和不足，提供一種隱孢子蟲蛋白激酶的純化方法。

本發明的第一個目的是提供一種隱孢子蟲蛋白激酶的純化方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

一種隱孢子蟲蛋白激酶的純化方法，包括如下步驟：

S1.制備誘導表達蛋白

S11.構建含隱孢子蟲蛋白激酶基因的原核表達載體；

S12.將S11的原核表達載體轉入表達宿主菌，挑取陽性克隆菌，保存；

S13.將S12挑取的陽性克隆菌經擴大培養至對數生長期后進行誘導表達；